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蛋白MARKER知多少?

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发表时间:2021-12-13 11:07作者:诺扬生物来源:雅酶
前   言

      做WB的小伙伴都会用到蛋白Marker。关于蛋白Marker,小编经常接到技术咨询电话如何选择蛋白Marker,蛋白Marker条带不准,Marker条带消失、弥散,Marker条带能不能曝光出来……等问题。今天小编就带大家从以下几个方面来详细了解一下蛋白Marker。



蛋白Marker的定义

     

      蛋白Marker:即蛋白分子量标准,是一些已知分子量的蛋白质的混合物,像“尺子”一样用来指示蛋白质条带的大小。


蛋白Marker的分类

      目前最常用的蛋白Marker分为非预染蛋白Marker、预染蛋白Marker

非预染蛋白Marker

是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液。非预染Marker在电泳过程中看不到,电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用,无法在实验过程中起预示作用。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子,所示大小正好是蛋白原本的大小,所以最准确。

预染蛋白Marker

是纯化好的几种蛋白,通过与染料共价耦联后混合在一起,在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到的一种蛋白Marker。

预染蛋白Marker在电泳过程可以起到预示作用,当观察目标蛋白大小位置进入最佳分辨区时,停止电泳,以得到最佳分辨效果。转膜过程可以监测转膜效率,同时可以在膜上标记蛋白分子量。

但是蛋白分子标记了染料后,由于染料标记效率存在一定的波动,所以各个批次间蛋白   Marker大小可能会存在一定的偏移,也就是预染蛋白Marker条带代表的是相对大小,而不是绝对大小。



预染蛋白Marker的分类

      预染蛋白Marker,又分单色预染Marker、双色预染Marker,多色预染Marker。如图:


      单色预染蛋白Marker通常会加深某些条带的粗细,方便我们快速记忆和区分各个条带的大小。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色,更加方便记忆区分。


      除了上面介绍的,市面上还有一些其他类型的蛋白Marker:如显影蛋白Marker等。

      显影蛋白Marker,蛋白条带中含有lgG结合位点,lgG结合位点会结合用于检测靶蛋白的一抗或二抗,使得蛋白Marker在印迹膜上可与目的条带一同呈现。



蛋白Marker的选择

      首先明确自己实验目的,如果只需要电泳后观察蛋白条带大小,可以用非预染蛋白Marker,毕竟价格便宜,且条带大小准确。如果做WB实验,可以选择预染蛋白Marker,这样可以实时观察到电泳、转膜情况。

      预染蛋白Marker的选择,我们主要可以从以下几个方面考虑。



    分子量范围:

蛋白Marker又分为高分子量、低分子量、宽分子量几类。检测大分子量蛋白经常使用到高分子量范围Marker,检测小蛋白甚至是一些多肽常会用到小分子量范围Marker。如果从整个实验室考虑,选宽分子量、条带分布比较均匀的Marker,这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断。


    条带准确性:

    可以用非预染蛋白Marker作为参考、校准。



    稳定性:

    偶联的染料是否容易脱落,使条带颜色变浅,Marker是否容易降解。



    膜的亲和性:

    转到膜上因为要多次洗膜,长时间孵育,所以Marker蛋白与膜的亲和性也十分

   重要。



常见问题:

      预染Marker准确性问题、电泳过程中Marker条带异常、显影时,Marker曝出条带等。
预染蛋白Marker的准确性

      预染蛋白Marker,染料的标记反应和蛋白质的其它标记反应一样,其实际标记效率由于各种各样的因素而波动于一个合理的区间,不是一个确定的常数。在预染蛋白Marker的生产过程中,染料标记效率的波动将直接影响到最终标记产物的分子量大小。因此厂商都有一套优化的条件来实现相对稳定的染料标记效率。即使如此,标记效率的稳定性仍然不可能达到一个稳定的常数,仅能将其控制在一个比较小的波动范围。其结果是,染料标记的蛋白质产物的分子量在不同批次间会存在一定的波动。这就是我们俗称的分子量准不准的问题。由上述原理可知,没有哪家公司的预染蛋白Marker具有绝对的准确性。正如Thermo在其产品说明书中明确写道,预染蛋白Marker仅用作为蛋白质分子量的近似参考,不同批次产品间具有不大于5%的批间差异。

      不同的蛋白质(不考虑修饰) ,即使分子量相同,也有可能(比例较小)由于氨基酸组成的不同等因素,而表现出泳动迁移率的差异。实践中,这种看起来似乎不符合电泳原理情况常常会出现,相信做实验比较多的小伙伴可能也曾遇到过。

      同一蛋白Marker产品的谱型在不同体系的电泳中,也会出现不同的泳动行为。例如下图。


     此外,相比于预制的梯度凝胶,在自制的固定浓度凝胶中,预染蛋白质分子量标准的条带会看起来显得略粗一些,而不如前者锐利。当条带较粗的时候,我们的实践经验显示,分子量的参考一般应以条带的上半部为准。

      有些小伙伴的WB结果参照蛋白Marker,与预期大小不符,第一反应就是Marker不准。那么除了我们上面分析的预染蛋白Marker本身的准确性的问题,还有没有其他原因呢?

      SDS-PAGE凝胶电泳按照分子量大小将蛋白分离,是蛋白在充分变性、还原条件下,使蛋白分子带上均匀密度负电荷,蛋白分子的形状是短轴一样的链状结构(单条肽链)来实现的。如果蛋白样品未充分变性、还原,其形状和电荷等因素会影响迁移率从而导致分子量与预期不符合。下图(1为变性、还原BSA(66KD);2为变性、非还原BSA)。


      由于基因表达的差异性,同种蛋白在不同来源样品中分子量可能略有差异。下图:来源CST(使用 GAPDH (D4C6R) Mouse mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。)

      另外蛋白样本出现部分降解也可能会出现条带变小。由于蛋白序列的差异,降解的原因的不同,所以即使同一管样品,不同的蛋白可能降解程度不同。


    除此之外,最近有客户做Ip实验遇到重链、轻链问题。反馈说跑出来的轻链条带位置,在雅酶Marker的25kd以下,认为雅酶Marker条带不准。客户普遍认为轻链是25kd,实际上轻链在22-23kd范围,下图(merck官网)。


电泳过程中Marker条带异常

     

1

        大条带消失:

Marker条带跑不出或者大条带消失原因一种是Marker本身降解,一种是电泳过程中降解。如果本身降解,电泳一开始应该就是模糊或者条带缺失的。如果是电泳过程中降解,是刚开始有,跑着跑着大条带消失。电泳过程降解,多是因为外槽电泳液加的非常满,和内槽液直接连通,导致短路,或者电极老化短路导致。

2

        小条带弥散或者消失:

可能是电泳液中不含SDS或者SDS含量低于正常用量。



显影时 Marker曝出条带

        蛋白Marker每一个条带是单一纯化的蛋白,相对于目的蛋白其在膜上含量很高,所以如果抗体浓度以及抗体孵育的时间不合适,容易发生Marker蛋白和抗体非特异性结合,从而爆出条带。可以降低抗体浓度或者减少孵育时间,以及减少Marker上样量来优化。



雅酶多色预染蛋白分子量标准








产品内容


货 号产品名称   规 格产品价格
WJ101双色预染蛋白Marker 15kDa~150kDa250μL×2398元
WJ101L双色预染蛋白Marker 15kDa~150kDa250μL×101488元
WJ102双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa250μL×2448
WJ102L双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa250μL×101688元
WJ103三色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa250μL×2448元
WJ103L三色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa250μL×101688元
WJ106

双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa 适用于近红外荧光成像系统

250μL×2448元
WJ106L

双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa 适用于近红外荧光成像系统

250μL×101688元
WJ201
非预染蛋白Marker(10kDa~235kDa)
250μL×2158元

注:WJ106 系列适用于近红外荧光成像系统。







产品特点

g   高准确性 —— 蛋白条带分子量相较于同级别其它高端品牌产品更准确;

g   分布合理 —— 蛋白条带分布更合理;

g   低杂交反应 —— 条带蛋白去除蛋白质标签,最大程度降低抗体杂交反应;

g   高性价比 —— 与其它同级别产品相比,性价比极高。







发表文献

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本期福利


1、即日起至2022年1月31日,订购任意一个雅酶多色预染蛋白分子量标准大包装(WJ101L/WJ102L/WJ103L/WJ106L)均赠送100元京东卡,多买多送。
2、谈谈您在使用蛋白Marker中的体验或遇到的问题,一经精选,赠送100元京东卡,限前20位。
注:本次赠送京东卡活动对象仅限于终端客户,由各区域授权代理商发放,经销商不参与此次活动


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