细胞培养知识库：细胞培养实验室1（二）

除大多数日常工作场所常见的安全风险（如电气和火灾危险）外，细胞培养实验室由于要操作和处理人或动物细胞和组织以及一些有毒、有腐蚀性或者有致突变性的溶剂和试剂，因而还具有一些特殊的危险。其中，最常见的一些危险包括: 注射器针头或者其他污染锐器刺伤、液体泼溅到皮肤和粘膜上、经口吞入毒物以及吸入感染性气体挥发。

任何生物安全程序的基本目的都是为了减少或避免实验室工作人员和外部环境与潜在危害性生物物质的接触。细胞培养实验室中最重要的安全要素是严格遵守标准微生物学准则和技术。

生物安全等级

美国的生物安全法规和建议载于由疾病控制与预防中心（CDC）和美国国立卫生研究院（NIH）编写，由美国卫生与公共服务部颁布的《微生物学及生物医学实 验室生物安全准则》中。该准则定义了四个递增的防护等级，分别为生物安全一级至四级，介绍了按照操作某一制剂时对应的危险等级应遵守的微生物学准则、应使用的安全设备以及应采取的设施安全措施。

生物安全一级（BSL-1） BSL-1是大多数研究和临床实验室常用的基本防护等级，适用于已经明确鉴定的，不会在正常健康人体内引起疾病的活性微生物。

生物安全二级（BSL-2） BSL-2适用于已知会通过吸入或经皮或粘膜暴露而引起不同严重程度人类疾病的中等风险生物因子。大多数细胞培养实验室应至少达到BSL-2级，但具体要求取决于所使用的细胞系以及开展工作的类型。

生物安全三级（BSL-3） BSL-3适用于已知有可能通过气体挥发传播的本地或外来性生物因子，以及可能导致严重和潜在致命感染的生物因子。

生物安全四级（BSL-4） BSL-4级适用于可通过气体挥发传播，对个人造成危及生命的不治之症的外源性生物因子。这些高致病风险的生物因子必须控制在高防护等级的实验室内。

SDS

安全技术说明书（SDS）是一种包含特定物质属性信息的表格，其中包括熔点、沸点和闪点等物理数据，以及关于其毒性、反应性、健康影响、储存、处置、建议使用的防护装备和溢出处理的信息。

安全设备

细胞培养实验室中的安全设备包括一级屏障，如生物安全柜、封闭容器和其他用于消除或尽量减少危险物质暴露的工程控制设备，以及通常与一级屏障一起使用的个人防护装备（PPE）。生物安全柜（即细胞培养通风橱）是最重要的设备，可限制许多微生物操作引起的感染性泼溅物或气体挥发。

个人防护装备（PPE）

个人防护装备（PPE）在人员和危险源之间形成直接屏障，包括个人防护用品，如手套、实验室外套和防护服、鞋套、防护靴、呼吸器、面罩、安全防护眼镜或护目镜。它们通常与生物安全柜和其他包含被处理制剂、动物或材料的设备配合使用。

补充

1.请注意尽量减少气体挥发和泼溅。

2.在实验开始前和结束后，都应对所有工作台面进行消毒。在任何可能具有感染性的材料溢出或溅出后，均应立即使用适当的消毒剂进行消毒。即使未被污染，也应定期清洁实验室设备。

3.在处理废弃物前，应对所有培养物、储存物和其他可能具有感染性的材料进行消毒。

4.若发生了任何可能导致感染性物质泄漏的事件，均应向相应人员（例如，实验室主管、安全员）报告。

细胞培养实验室的具体要求主要取决于开展的研究类型；例如，专门从事癌症研究的哺乳动物细胞培养实验室的要求与专门研究蛋白质表达的昆虫细胞培养实验室的要求就存在很大差异。但是，所有细胞培养实验室均有一个共同的要求，即没有病原微生物（即无菌），并且均有一些细胞培养必需的基本设备。

下文列出了大多数细胞培养实验室常用的设备和用品，以及使工作更为高效、准确，或可提高检测和分析范围的实用设备。

基本设备

1.细胞培养超净工作台（即层流超净台或生物安全柜）

2.培养箱（推荐使用湿式的CO₂培养箱）

3.水浴锅

4.离心机

5.冰箱和冰柜（-20°C）

6.细胞计数仪

7.倒置显微镜

8.液氮（N2 ）冷冻柜或冻存容器

9.灭菌器（即高压灭菌器）

扩展设备

1.抽吸泵（蠕动泵或真空泵）

2.pH计

3.滚轮架（用于扩大单层培养的规模）

4.共聚焦显微镜

5.流式细胞仪

6.生物反应器

7.细胞培养小室

其他用品

细胞培养容器（例如培养瓶、培养皿、多孔板）

移液管和移液器

注射器和针头

废物容器

培养基

胎牛血清

双抗

无菌工作区

细胞培养实验室的主要要求是需要保持一个仅限于细胞培养工作的无菌工作区。尽管最好使用单独的组织培养室，但在较大实验室中划出一定的细胞培养区同样可用于无菌操作、细胞培养、以及试剂和培养基的储存。提供无菌条件的最简单、经济的方法就是使用细胞培养通风橱（即生物安全柜）。

细胞培养通风橱提供了一个无菌工作区，同时可以抑制许多微生物学操作产生的感染性泼溅或气体挥发。细胞培养通风橱有三种，分别为I级、II级和III级，以满足各种研究和临床需求。

细胞培养通风橱的类别

I级细胞培养通风橱 配合良好的微生物学技术，可为实验室人员和环境提供相当水平的保护，但此类通风橱无法防止培养物污染。它们的设计和气流特性类似于化学品通风橱。

II级细胞培养罩通风橱 用于涉及BSL-1、2和3物质的工作，也为细胞培养实验提供 所需的无菌环境。II级生物安全柜应用于处理潜在危险材料（例如，来源于灵长类动物的培养物、病毒感染培养物、放射性同位素、致癌或有毒试剂）。II级生物安全柜是目前最常见的细胞培养通风橱类型。

III级生物安全柜 是气密性设备，可为人员和环境提供能达到的最高水平防护。在涉及已知人类病原体和其他BSL-4材料的工作中，需要使用III级生物安全柜。

细胞培养通风橱的气流特性

II级生物安全柜保持稳定的、单向的HEPA过滤气流从安全柜顶部吹到工作台面，从而保护工作环境免受灰尘和其他悬浮污染物的影响。这些培养通风橱（即II级BSC）能为使用者和细胞培养物提供显著的保护。

超净工作台

水平层流或垂直层流“超净工作台”不是生物安全柜；这些设备将经HEPA过滤的 气流从安全柜背面经由工作台面吹向使用者，这可能会使使用者接触到潜在的危 险物质。这类设备仅能为产品提供保护。超净工作台可用于某些洁净操作（例如无菌设备或电子设备的无尘组装），但在操作细胞培养材料或药物配方，以及处理潜在感染性材料时，请勿使用超净工作台。

细胞培养通风橱布局

II级生物安全柜大小应足够一人使用，内外易于清洁，照明充足，使用舒适，且不会导致体位不便。保持细胞培养通风橱内的工作区域干净、整齐，所有物品均在直视范围内。对放置在细胞培养通风橱内的每件物品，用70%乙醇喷洒消毒，并擦拭干净。细胞培养通风橱内物品的排列通常遵循以下右手使用用习惯，在特定应用需要增加其他物品时，可做适当调整。

1.中心工作区域开阔、清晰，用于放置细胞培养容器；

2.移液器置于右前方，玻璃移液管置于左侧，方便拿取；

3. 试剂和培养基在右后方，便于吸取；

4.后部中间有放置一个小型容器，用于收集废液；

在II级BSC内“从洁净到脏污”工作的典型布局。左侧的洁净培养物（左）可在中央区进行接种；右侧的浅盘用于丢弃受污染的移液器，而生物危险品袋则可盛放其他受污染的材料。对于惯用左手的使用者而言，则可采取相反的排列。