细胞培养中出现的小黑点到底是什么？

非生物类

细胞碎片类

在细胞培养的时候， 由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小碎末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现；

再者，“小黑点”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“小黑点”病原体根本难以收集和捕捉， 这也从另一个侧面证明了“小黑点”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。

举一个例子：如果“小黑点”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。

比如说：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“小黑点”感染中，是很难观察到的。同时“小黑点”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“小黑点”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以小黑点属于细胞碎片是比较可能和合理的。

玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西

网上有一篇文章说，小黑点其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不明显。细胞状态较差，数量少时才容易看到，最好的办法是用一次性培养瓶，可消除小黑点影响。

血清聚合物产物

Gibco公司的血清说明，此物为血清聚合产物，而不是微生物。

生物类

支原体

有人曾认为小黑点可能是支原体污染，因为相对比较权威的网站文章指出，小黑点可以通过滤膜，可以在空气中传播。而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。但有人为此做了实验证明小黑点不会是支原体，原因如下：

1、光镜下可见, 因为体积不对，支原体在普通显微镜下不能看到。

2、多种染色后可见，甚至hoechst即能将它染色,一般来说支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。所以，小黑点是一种支原体的可能性比较小。

真菌

有很多人发现类似小黑点的，但最后确定是真菌，二性霉素B对其有效。那说明小黑点不存在只是细胞培养中的真菌感染，还是说明小黑点属于真菌类污染物。如果小黑点是一种真菌，那么由此引起的污染是不会引起那么多人的关注，即使它很特殊。但是这不能排除那些认为“小黑点”是真菌的细胞者，看到的只是一般真菌感染。由于细胞被感染了，要进行拯救处理，不像理论上那么简单，稍有不注意都是很容易导致培养失败，所以小黑点是一种真菌也是不太可能。

寄生类原虫

小黑点属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到它有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光；另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染小黑点的血清4周，直到满视野都是黑煤渣般的小黑点。给人的感觉是小黑点和细胞一样有丛集性，如果密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺，所以有人认为细胞旁分泌的某些因子可以抑制小黑点的生长。

据说，中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去，所以并没有明确的证据证明此项猜测的正确性。

实验室从某细胞中心购买一批细胞，细胞刚寄到的时候，培养瓶口处的封口胶完好（没有培养液溢出的痕迹），倒置显微镜下观察细胞形态良好，密度适中，培养液未见浑浊或是异物。细胞置于实验室培养箱中过夜，次日传代，传代培养约一周后在镜下观察到细胞密度降低，还发现了一些奇怪的小黑点。

经过观察发现，在低倍镜下这些散在的小黑点仿佛一层模糊的黑点状背景，在高倍镜下仔细观察发现黑点似乎在抖动。这些小黑点到底是常见的微生物污染（细菌、真菌和支原体等），还是细胞碎片或者是某试剂中的杂质呢？

微生物污染？

处理：

连续观察细胞状态，清洗细胞，并用多种抗生素“诊断性治疗”和染色的方法分析的链霉素；另一瓶细胞采用25ug/ml的制霉菌素处理；Hoechst 33258染色后用荧光显微镜观察，取适量培养基置于无细胞的培养瓶中过夜，在镜下观察有无小黑点。

结果：

PBS清洗细胞，可以改善镜下视野的背景，但继续培养小黑点又会再次出现。镜下见细胞间隙较大，部分细胞中可观察到少量颗粒状物质，但是在小黑点增加的过程中细胞状态没有进一步变差。无细胞的培养瓶中没有出现较多散在的小黑点样物质。单纯加用青霉素、链霉素或制霉菌素分别处理细胞后，镜下的黑色小点未见明显减少。Hoechst 33258染色后未在荧光显微镜下观察到细胞膜表面的绿色小点。

结论：

细胞状态欠佳。另外，由于常规抗生素处理效果不明显，荧光染色也未发现特异部位的染色，而且培养液外观未见浑浊、细胞状态也没有进一步变差，这提示小黑点不是我们实验室中常见的细菌、真菌或是支原体污染。

非生物类的杂质？

经过尝试性的抗生素处理，虽然不能完全肯定小黑点不是微生物污染，但是可以初步得出常规抗生素无效的结论。虽然在镜下看到这些小黑点的确让人很心烦，但是对于我的细胞状态并没有产生进一步持续恶化的负面影响。接下来我考虑从细胞和试剂角度进行分析。

处理：

一方面使用新一批的血清，且不经过热灭活处理，重新配制培养基，用于细胞培养，并进行观察；另一方面将新配制的培养基用于同一实验室未出现过小黑点的原代细胞培养，持续观察是否出现小黑点。

结果：

使用未经热灭活处理的血清培养的细胞，镜下视野中观察到的小黑点数量比原培养基细胞中的少，但是还是可见少量小黑点存在。使用新培养基的原代细胞中没有出现小黑点样物质。

结论：

综合考虑认为，我在此次实验中遇到的小黑点可能是细胞碎片以及血清聚合物等非生物类的杂质。

为什么会出现小黑点？

在排除了常见微生物污染的基础上，此次实验中的非生物性杂质是如何产生的呢？我认为，与未出现小黑点的原代细胞相比，复苏细胞经过邮寄运输后，在新环境和营养条件下进行培养，细胞状态受到了影响，造成了细胞碎片增多，而细胞器或碎片散在分布于培养液中，镜下就呈现为小黑点状物质。

小黑点在复苏细胞的传代培养过程中逐步出现，且经过PBS多次清洗后换液出现镜下小黑点减少、但继续培养又会增多的现象也支持这一判断。同时也存在由于热灭活过的血清中沉淀物质增多，以及血清中存在特殊聚合物等因素的影响。

为什么此实验中的黑色小点与大家常常讨论的“黑胶虫”相似而又不同？

实验中我的细胞状态欠佳，但并未在小黑点的出现后越来越差，但朋友们讨论时提到的黑色小点，往往严重影响细胞状态，并形象地称之为“黑胶虫”。虽然有研究发现联合应用环丙沙星和哌拉西林可以消除细胞培养中运动的小黑点。但我认为，不同的实验人员所定义的“黑色小点”是有区别的，受主观因素的影响较大，有人描述的黑胶虫像细菌，有的像支原体，也有本次实验类似的细胞碎片，我们认为一方面可能有人遇到的是不常见的或者是对常用抗生素耐药的微生物污染，另一方面，同时也可能存在着因实验基础不扎实、对常见微生物污染认识不准确而生拉硬套定义出的“黑胶虫”，所以在处理时还不能够一概而论。

为什么会出现细胞状态好时小黑点数量较少，细胞状态不佳时，小黑点增多的现象？

如果是因为不常见或者耐药的微生物污染造成的小黑点，这种“此消彼长”的现象可以认为是微生物污染严重造成细胞状态的不良；但如果是非生物性的杂质或聚合物，我认为此时“此消彼长”现象的因果关系就应该是因为细胞状态不良而造成的细胞碎片（小黑点）增多了。