如何真正养好细胞？细胞质量控制是关键！（三）

细胞周期反应了细胞增殖速度，它也是衡量细胞质量控制的重要环节之一。细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。

生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂， 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

1、G1期（first gap）从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。

2、S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。

3、G2期（second gap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。

M期：细胞分裂期。

       细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

1、前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

2、中期（metaphase）细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个，其中44个为常染色体，2个为性染色体。男性的染色体组型为44+XY，女性为44+XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

3、后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞被拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑 铃形。

4、末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

细胞生命活动大部分时间是在间期度过的，如大鼠角膜上皮细胞的细胞周期内,间期占14000分钟，分裂期仅占70分钟。细胞周期各阶段都有复杂的生化变化。间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的时期，是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段。

       在一个增殖的细胞群中，所有细胞并非是同步增殖的，它们在细胞周期运行中，可能有四种命运：

1）细胞经M期又开始第二次周期；

2）停止于G2期，称为G2期细胞（R2），它受某种刺激后可进入周期；

3）停止在G1期，称为休止细胞或G0期细胞，这类细胞受某种刺激后仍能进入周期，继续进行有丝分裂；

4）丧失生命力近于死亡的细胞，称为丢失细胞，或称不再分裂的细胞。继续分裂的细胞沿着细胞周期从一个有丝分裂期到下一个分裂期。不再分裂的细胞离开了细胞周期不再分裂，最终死亡。

       同时从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：

1）连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。

2）休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。

3）不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。   

       细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。

细胞周期内有两个阶段最为重要：G1到S和G2到M，这两个阶段正处在复杂活跃的分子水平变化的时期，容易受环境条件的影响，如果能够人为的进行调控，将对深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。

标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。

有关名词：   TG1：G1期的持续时间、TG2：G2期的持续时间、TS：S期的持续时间、TM：M期的持续时间、TC：一个细胞周期的持续时间、PLM：标记的有丝分裂细胞所占的比例、TDR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特异前体，能被S期细胞摄入，而掺进DNA中，通常使用的是3H或者14C标记的TDR。

测定原理：

1）待测细胞经3H-TDR标记后，所有S期细胞均被标记。

2）S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。

3）开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。

4）S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M，进入G1期。所以从开始出现M到PLM达到最高点（≈100%）的时间间隔就是TM。

5）当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现LM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。

6）从LM出现到下一次LM出现的时间间隔就等于TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。

检测原理：

       细胞周期各个时期其DNA含量不同，利用荧光染料碘化丙啶(PI）能够和细胞内DNA结合的特性，根据不同DNA量结合的荧光染料量不同，因而流式细胞仪检测的荧光强度也不一样，可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。

操作步骤：

1. 收集细胞：

1) 悬浮细胞直接离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2) 贴壁细胞用胰酶消化后离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，胰酶消化应严格控制，不能消化太过，操作过程要尽可能减少细胞机械损伤。

2. 固定细胞：加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。这一步必须说明下，乙醇固定时间不能太短，此步的目的有2个：

1) 为了后续染色时PI能顺利进入细胞。

2) 增加膜通透性后，让小片段核酸游离出细胞，减少非基因组DNA核酸的干扰。

3. 细胞染色：

1) 离心收集固定过夜的细胞，以1mL的PBS洗细胞一次。

2) 加入500uL含50ug/mL溴化乙锭（PI）的PBS缓冲液，加100ug/mL RNase A和0.2% Triton X-100。

3) 4℃避光孵育30分钟。

特别说明：RNase A和Triton两个都是非必须品，实践显示对实验结果没有太大影响。

4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件分析。

注意事项：

1）固定时间必须过夜(18小时以上)。

2）细胞收集和洗涤操作需尽可能减少细胞的机械损伤，机载损伤可造成细胞DNA丢失而影响结果准确性。