如何真正养好细胞？细胞质量控制是关键！（二）

细胞凋亡是检测细胞活力及生长状态的重要指标，是细胞死亡程序中的重要一环，也是科研工作者们在基础和临床科研中常用的诊断标准。

   细胞凋亡的特征   

      早期形态学改变是细胞皱缩，细胞体积减小，继而细胞核染色质浓聚、固缩，聚集在核膜周边，呈新月状、块状或破裂状。然后是胞浆浓缩、胞膜起泡，最终细胞核裂解成若干碎片，细胞膜将胞质和染色质断片包裹，胞浆内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及“凋亡小体”。这不同于细胞坏死表现为细胞膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形肿大，最后细胞溶解破裂，溶酶体酶泄漏，并常引起炎症反应。细胞凋亡在生化学上表现为ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳呈梯状条带； 细胞凋亡无炎症反应。死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除，不留瘢痕，不影响其他细胞的正常功能。

   细胞凋亡与坏死的区别   

细胞凋亡是一种主动的，程序性的死亡过程，不造成炎症和自体损伤。

细胞坏死指细胞在各种致损伤因素作用下无序死亡的过程，形态特征为细胞胀大、胞膜破裂、胞浆内容物外泄，局部导致炎症反应。

   实验室常用的细胞凋亡检测方法   

一、细胞凋亡的形态学检测   

根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。   

1.光学显微镜和倒置显微镜

1）未染色细胞：

凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

2）染色细胞：

HE染色：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。  

台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

2.荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

DNA特异性染料Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI等，与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合，从而使细胞核着色，在紫外光激发时会出现明显的荧光。通过荧光显微镜可观察到细胞染色质的形态学变化及膜结构与通透性的改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

优点：简便易行，可用于细胞涂片或滴片定性观察细胞凋亡现象。

缺点：观察细胞凋亡的形态特征耗时费力，所以不使用大量凋亡样本的检测。

3.透射电子显微镜观察     

电镜形态学检测能够为细胞凋亡提供直观的证明，是观察细胞形态变化的最好方法，可清楚地观察到细胞核及亚结构其变化。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现，其特征是细胞核体积缩小， 染色质浓缩致密， 并沿核膜分布形成新月体状，细胞膜微绒毛消失， 但细胞浆内的各种细胞器基本正常。而普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体，但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构， 因此用光镜观察难以令人满意。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法， 被认为是确定细胞凋亡的金标准。

二、细胞凋亡的DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

1.DNA Ladder测定细胞凋亡时，由于核酸内切酶被激活，DNA被切成50~300kb大小的片段，然后进一步分解成约180bp的整数倍的寡核酸片段。用琼脂糖凝胶电泳检测显示梯形条带，而坏死细胞DNA则被降解成弥散的条带。DNA Ladder 法检测细胞凋亡方法如下：

1）凋亡处理：细胞经凋亡处理后，收集细胞（包括悬浮细胞），用70%乙醇-20℃固定2h。

2）裂解细胞： 加400ml细胞裂解液，充分摇匀后再加蛋白酶K（10mg/ml），置65℃水浴消化至少2h或过夜。

3）处理蛋白：加75ml 8mol/L KAc，4℃ 15min，再加750ml氯仿，充分混匀后，离心5000r/min 10min后，将上清移至一新的EP管。

4）沉淀DNA：加入750ml无水乙醇，轻柔摇匀即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min，10min离心后，用70%乙醇洗DNA两次。

5）溶解DNA：加50ml无菌双蒸水，37℃溶解DNA。

6）测定DNA的浓度。

7）2%琼脂糖凝胶电泳80V 2h。

结果：

优点：经典的检测细胞凋亡的指标。

缺点：DNA凝胶电泳特异性高但灵敏度低，不适于检测凋亡初期DNA轻微损伤的检测。

2.凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

方法：

     收集细胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10min RNase A （0.5mg/ml） 37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

结果：

3.大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。

4.ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。

三、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

方法：

1.贴壁培养的细胞染色：

先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

2.悬浮细胞的染色：

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1x106）用PBS洗2次，加入100ulBinding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

3.爬片细胞染色：

同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

结果：

注意事项：

1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

四、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析　　

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

（一）TFAR19蛋白的细胞定位分析

材料试剂：

FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。

仪器：

低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计

方法：

1.贴壁细胞的原位染色：

1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

结果观察：

2.悬浮细胞的染色：

1）收获正常和诱导凋亡的细胞，PBS洗2次，1000rpm′10min。

2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4°C反应30min。

6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm 10min。

结果观察：

将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。

3.原代细胞的培养、检测。

4.临床病理切片的染色、检测。

5.分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位。

（二）TFAR19蛋白的表达与临床疾病

1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。

材料和试剂：

1）包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer。

2）洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20。

3）封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）。

4）酶标抗体的稀释：用封闭液稀释。

5）OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g、柠檬酸 0.51g、DDW 100ml。

6）显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml、OPD 2mg、30%H2O2 2ml。

7）终止液 2Mol/L H2SO4。

8）重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISAReader（OD490nm），洗板机 。

操作步骤:

1） 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜（一般24h以上）。

2） 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C过夜。

3）洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。

4）洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。

5）洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。

6）加入H2SO4终止反应，50 ml/well。

7）ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。

五、线粒体膜势能的检测　

线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

方法：

将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

注意事项：

1.始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

2.与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

六、TUNEL法

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3"-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3"-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3"-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

优点：敏感、快速、特异性强。

缺点：局限性，组织固定、处理的过程本身会改变实验结果。对细胞凋亡不是特异的，坏死细胞也会被标记。           

七、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：

收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果：

2.荧光分光光度计分析

原理：

活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：

收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，制备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）37°C反应1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。

结果：

3.流式细胞术分析

方法：

收获细胞正常或凋亡细胞,PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC 37°C反应1h UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。

结果：