动物细胞培养指南（一）

细胞是我们做很多实验研究的基础，那么如何成功的复苏、培养就尤为关键了。

收到细胞的注意事项

一般从细胞库购买的细胞通常保存在冻存管中用干冰运输，或是在培养瓶中常温运输。在收到冻存细胞后，很重要的一点是迅速解冻使其立即复苏并除去DMSO，然后将它们放置到培养基中。如果做不到上面这点，需将细胞存储在液氮中（-130℃以下）。不要将冻存细胞储存在高于-130℃的温度下，这会使细胞存活率迅速下降。

了解细胞特性

在细胞培养之前，我们要了解一下你所要养细胞的基本特性，这点可以从细胞的产品说明书或者从ATCC细胞库查询。除此之外我们还要知道每管细胞的数量，建议分裂或传代的比例，和已知细胞的传代代次等信息。

准备培养基

复苏细胞时需要准备合适的培养基，血清和细胞生长所需的添加剂。大部分培养细胞所用的培养体系，可以在订购细胞系时获得。

虽然大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长，但是当培养基改变时，细胞的性质也会变化。因此，使用细胞库推荐的培养基来培养细胞会获得最好的效果。

开启冻存管

1.准备一个培养瓶，加入适宜细胞培养的培养基，液体体积按照说明书的推荐配置，并平衡培养基的温度和pH（CO₂）。　　　　　

2.在37℃水浴中或细胞的正常生长温度下将冻存管轻轻摇动。解冻要快，约2分钟或直到冰晶融化即可。

3.从水浴中取出冻存管并用浸泡或喷洒70%乙醇的方式来消毒。进一步的操作均需在无菌操作台中严格无菌条件下进行。

4.拧开冻存管的管帽并将内容物转移到一个含有9 ml推荐培养基的无菌离心管中。通过温和离心（125×g 10 min）除去冷冻保护剂（DMSO）。弃去上清，并用1或2 ml完全培养基重悬细胞。将这些细胞悬液转移到含有完全培养基的培养瓶中并轻轻摇动以彻底混匀。

5.培养24小时后检查细胞状态并在需要时进行传代。

注：某些细胞系，如杂交瘤细胞，需要几天的时间才能从冻存状态完全复苏。某些杂交瘤细胞在培养的第一天活力较差，并会产生细胞碎片。在此之后，细胞就会开始复苏，并进入指数增长。

培养瓶培养

某些细胞，是在培养瓶中以活细胞的形式运输的。这些培养瓶中会接种细胞，孵育并保证细胞能生长，然后补充满培养基后再运输。

在收到培养瓶后，目视检查培养基是否污染。包括异常的pH变化（苯酚红变为黄色或紫色），浑浊度，或有无颗粒。在低倍率（100×）的倒置显微镜下观察培养基中是否有微生物污染以及细胞的形态。

如果细胞是单层贴壁生长：

1.无菌操作，取出大约5至10ml的运输培养基。运输培养基可以保存在4℃备用。

2.将培养瓶放在产品说明书中推荐的温度和CO₂浓度下培养（大多数细胞系为37℃与5%CO₂）直到细胞可以传代培养。

如果细胞不贴壁或是悬浮状态生长：

1.在无菌条件下，将培养瓶的全部内容物转移到离心管中。

2.在125×g转速下离心5～10 min。

3.取出大约10 ml运输培养基的上清液，并重悬细胞。将取出的运输培养基储存在4℃备用。

4.无菌条件下，转移悬浮细胞到25 cm²或75 cm²的培养瓶中，培养瓶大小取决于细胞株。

5.按照产品说明书中推荐的温度和CO₂浓度培养细胞，直到细胞可以传代培养。

原代细胞来源于一块碎的或酶消化的组织。原代培养物，是多种类型细胞的混合物，保留了其来源组织的特点。

一段时间后，原代培养的细胞会达到融合状态，即在培养瓶中的所有可用空间由于细胞扩增都被覆盖。在此之后，细胞需要消化（通常用蛋白水解酶，如胰蛋白酶）为单个细胞并且传代（分裂，传代或转移）。在第一次传代以后，培养物通常被称为一个细胞系。每一次传代培养，细胞群体由于快速生长的细胞占主导地位而变得更均匀。具有所需特性的细胞也可以通过克隆，从培养物中选出。

二倍体细胞很少可以倍增超过几代。它们只有有限的复制能力，并且在细胞倍增20至80次后开始减缓并最终停止分裂。最近的证据表明，某些细胞中观察到的细胞衰老与预计的复制性衰老不同，可能是由于不适当的培养条件导致的。还有其他数据显示，对某些物种的细胞系（尤其是人源的）即使生长在改进的培养条件下仍存在复制衰老。这种衰老是由细胞分裂时染色体末端（端粒）缩短调控的。

相反，传代（或永生化）细胞具有无限增殖能力。这些细胞系通过多种手段中的其中一种来使细胞永生化或转化。许多传代细胞来自肿瘤组织。一般细胞库收集的大部分细胞系是传代的，只有少数是有限传代的。

正如以上提到的，细胞系要么在培养瓶表面贴壁生长（锚定依赖性）要么悬浮生长（非锚定依赖性）。细胞的生长和分裂，通常遵循一个由四个阶段组成的特征性增长模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。

停滞期——将细胞接种至培养瓶之后，细胞逐步恢复的同时，缓慢生长。

对数期（指数期）——细胞进入一个对数生长的时期，一直持续到整个生长表面被占满或细胞密度超过培养基提供营养的能力。

平稳期——细胞增殖减慢或停止。

衰退期——如果不更换培养基且细胞数量不减少，细胞活力会下降，并出现细胞死亡。

为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。这意味着细胞需要在进入平稳增长阶段之前，或在单层细胞长成100%融合之前，或在悬浮细胞达到推荐的最大细胞密度之前定期进行传代培养。为每个细胞系绘制生长曲线，对于测定该细胞系的生长特性是必要的。