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流式抗体同型对照知识

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发表时间:2020-12-21 08:57作者:诺扬生物


什么是同型对照?

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白。


为什么要用同型对照?

同型对照是用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照,它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。严格来说,同型对照应该是同一抗原抗体制备的生产厂家,同一种属动物来源,同一种免疫球蛋白(包括亚型),同一荧光标记


如何选择同型对照?


情况一:

直接免疫荧光染色法一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体。

: PE anti-human CD3(FHP003)抗体,成份是mouse IgG1。那么它的同型对照应该是PE mouse IgG1(FMCP001)。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.

染色方式如下:样本管:一抗+样本,同型对照管:同型对照+样本。


情况二:

如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。

例:Mouse Anti-CD3的纯化抗体,成分是mouse IgG1。它的同型对照是Purified anti-mouse IgG1。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1。

染色方式如下:样本管:Mouse Anti-CD3的纯化抗体+PE标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本,同型对照管:纯化的同型对照+PE标记的抗小鼠IgG1(二抗 )+样本


情况三:

如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的顺序应该是亚链不同——亚型不同——相同类别。

例如:PE anti-human CD3来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照,那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b,那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。


为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高?

1.检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。

2.有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。


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