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Thermo-癌症代谢通路之抗体验证

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发表时间:2022-06-22 16:49作者:诺扬生物来源:Thermo
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研究中,代谢重编程是癌细胞的一个指标[1]。即使在有氧的条件下,癌细胞仍然倾向于将葡萄糖代谢成丙酮酸盐、继而有氧糖酵解乳酸(又被称为Warburg effect),而不是相比之下更有效率的氧化磷酸化途径[2]。这个发现有助于将代谢紊乱与癌症联系起来[3]。

癌症相关代谢特征分为:(1)不受调控的葡萄糖和氨基酸摄入,(2)投机取巧地获取营养,(3)利用糖酵解或三羧酸(TCA)循环的合成中间体,用于生物合成和产生NADPH,(4)氮需求增加,(5)代谢物驱动的基因调节的改变,(6)与微环境有代谢互作。这些代谢的特性中,葡萄糖和谷氨酰胺代谢被广泛研究,其中一些关键蛋白正在被研究是否适用于干预治疗[4,5]

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Altman, B., Stine, Z. & Dang, C. . Nat Rev Cancer 16, 619–634 (2016)

那么,我们有哪些可用于癌症代谢通路研究,且经过高级验证的Invitrogen抗体呢?

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糖代谢抗体


研究已发现,缺氧能够通过激活HIF1-α、GLUT1、HK2、PKM2、PDK、ENO1或LDHA,来增强乳酸的产生和肿瘤的生长。在大多数癌细胞中,PKM2上调,会导致代谢途径重新定向乳酸的产生[6]


Invitrogen™抗体使用siRNA介导的敲低来减少靶标表达,从而保证了这些抗体的特异性。图1显示了在存在siRNA介导的基因敲除的情况下,使用多种细胞系对Invitrogen™抗LDHA和抗PKM2抗体在Western Blot上的特异性。

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图1. LDHA和PKM2抗体特异性的确认

实验条件滑动查看

(A) LDHA的蛋白质印迹分析是使用各种细胞系的膜富集提取物进行的。用Invitrogen™LDHA抗体ABfinity™兔寡克隆 (2.5 µg / mL, 货号711782)探测印迹,并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL)检测,1:4,000稀释,货号A27036)。观察到对应于LDHA的35kDa条带 (B)使用siRNA介导的LDHA敲低通过蛋白质印迹分析确定该LDHA抗体的特异性;光密度测定法分析显示,在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下,LDHA表达降低 (C)使用各种细胞系的膜富集提取物进行PKM2的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™PKM2多克隆抗体(1:1,000稀释, 货号PA5-23034)探测印迹,并使用山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL, 1:4,000)检测稀释)。观察到对应于PKM2的58kDa条带 (D) 使用siRNA介导的PKM2敲低通过蛋白质印迹分析确定该PKM2抗体的特异性;光密度测定法分析显示,在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下,PKM2表达降低。化学发光检测是使用Invitrogen™iBright™FL1000成像系统及Invitrogen™Novex™ECL化学发光底物试剂盒(货号WP2000) 进行的.


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葡萄糖代谢的表观遗传控制


糖代谢的表观遗传调控,主要通过NAD +依赖的去乙酰化酶家族(SIRT1-7)来进行,特别是SIRT6通过诱导GLUT1、PFK1、ALDOC、PDK1和LDHA的表达,上调葡萄糖代谢。线粒体乙酰化SIRT3起到抑癌作用, SIRT3失活会导致线粒体代谢紊乱 [7] 。图2A和2B显示了使用各种细胞系并在存在siRNA介导的SIRT3敲除的情况下,Invitrogen™抗SIRT3抗体对蛋白质印迹的特异性。


图2. SIRT3和TIGAR抗体特异性的确认

(A)使用各种细胞系的富含膜的提取物进行SIRT3的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™SIRT3多克隆抗体(1:1,000稀释,货号PA5-28402)探测印迹,

并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL,1 :4,000稀释,货号A27036)。观察到对应于SIRT3的29kDa条带

(B)通过使用siRNA介导的SIRT3敲低的蛋白印迹分析确定SIRT3抗体的特异性;密度测定法分析显示,在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下,SIRT3表达降低

(C)使用各种细胞系的全细胞提取物进行TIGAR的WB分析。用Invitrogen™ TIGAR多克隆抗体(1:5,000稀释,货号PA5-29151)进行分析,并使用山羊抗

兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL,1:4,000稀释) 。

观察到对应于TIGAR的30 kDa条带,在经阿霉素处理的MCF7细胞中TIGAR表达增加。按照图1所述使用iBright成像系统。


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致癌基因和葡萄糖代谢


致癌基因和抑癌基因与癌细胞中葡萄糖代谢的调节有关[8]。TIGAR蛋白(TP53诱导型糖酵解和细胞凋亡调控蛋白)的表达受野生型抑癌基因p53影响上调,导致果糖2,6-二磷酸生成受到抑制,葡萄糖代谢重新导向磷酸戊糖途径[9]。如上图2C显示了使用Western blot,验证了Invitrogen™抗TIGAR抗体在使用和未使用阿霉素处理的MCF7细胞中的特异性。


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研究谷氨酰胺代谢的抗体


谷氨酰胺是一种非必需氨基酸,可为TCA循环和脂质生物合成提供碳元素,在许多癌细胞中均观察到谷氨酰胺水平升高的现象。谷氨酰胺酶(GLS)辅助的谷氨酰胺水解会产生包括谷氨酸盐在内的多种代谢产物,随后,谷氨酸脱氢酶(GLUD)将其转化为α-酮戊二酸。致癌基因(例如c-Myc和K-ras),可以激活GLS1和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(GOT),而K-ras能够抑制增殖细胞中的GLUD1,因此这些谷氨酰胺代谢酶已成为潜在的癌症治疗靶点[10]。


图3显示了分别使用免疫荧光和Western blot,验证由siRNA介导的靶基因敲低得到的Invitrogen™抗GLS和抗GLUD抗体的特异性测试。


图3. 谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酸脱氢酶(GLUD)抗体特异性的确认

(A)在HepG2细胞中使用siRNA介导的免疫荧光/免疫细胞化学(IF / ICC)方法证实了Invitrogen™GLS抗体(克隆6H5L15),ABfinity™兔单克隆抗体(5 µg /mL,

货号701965)的特异性。;siRNA处理的HepG2细胞显示线粒体GLS表达降低。用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L) Superclonal™二抗检测Alexa Fluor™488(绿色,货号

A27034),使用ProLong™Diamond Antifade Mountant染色细胞核,以检测抗GLS抗体。用DAPI(蓝色,货号P36962)和细胞骨架F-肌动蛋白用Invitrogen™罗丹明

笔环肽(货号R415)标记。

(B) 使用各种细胞系的富集膜的提取物进行GLUD的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™GLUD多克隆抗体(1:2,000稀释,货号PA5-29492) 探测印迹,

并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL,1:4,000稀释度;货号A27036)。观察到对应于GLUD的55kDa条带。

(C)使用siRNA介导的GLUD敲低通过蛋白质印迹分析确定该GLUD抗体的特异性


本文提到验证过的Invitrogen™抗体信息如下


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除上述用于葡萄糖代谢的抗体外,Thermo Fisher Scientific还提供了广泛的针对各种TCA循环中间体以及脂质和脂肪酸代谢的经过应用测试的特异性抗体。图片

相关文献

1.Hanahan D, Weinberg RA (2011) Cell 144:646–674.
2.Warburg O,Wind F,Negelein E(1927)J GenPhysiol 8:519–530.
3.Pavlova NN,Thompson CB(2016)Cell Metab23:27–47.
4.Vander Heiden MG,DeBerardinis RJ (2017) Cell 168:657-669
5.Martinez-Outschoorn UE, Peiris-Pagés M, Pestell RG et al. (2017) Nat Rev Clin Oncol 14:11–31.
6.Kato Y, Maeda T, Suzuki A et al. (2018) Jpn Dent Sci Rev 54:8–21.
7.Hirschey MD, Shimazu T, Goetzman E et al. (2010) Nature 464:121–125.
8.Kroemer   G,   Pouyssegur   J   (2008)   Cancer   Cell 13:472–482.
9.Bensaad K, Tsuruta A, Selak MA et al. (2006) Cell 126:107–120.
10.Robinson MM, McBryant SJ, Tsukamoto T et al. (2007) Biochem J 406:407–414.


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