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雅酶-Western blot之 显影检测

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发表时间:2022-06-02 14:33作者:诺扬生物来源:雅酶
图片



      Western blot环节多,每个细节出现问题都会影响最终的结果。今天带大家了解一些Western blot操作最后一步,显影检测。

     Western blot是先通过凝胶电泳将蛋白样品进行分离,然后转印到膜上,再利用抗原抗体的特异性结合对靶蛋白进行检测分析(如下图)。



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具体是如何检测呢?

    通常用带有标记的二抗识别并结合一抗,通过对二抗上的标记进行显色检测。二抗带有的标记不同,检测方法也不同。Western blot检测方法主要有:显色检测荧光检测化学发光ECL检测



    显色检测

      通常用碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗。当底物与酶接触时,转化为沉淀,在膜上形成不溶性有色产物(如图)。显色检测已广泛使用多年,是一种最简单蛋白质印迹检测方法。底物由此产生的条带可以直接观察,不需要特殊设备进行处理或显色。


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优点:无需特殊仪器,适合检测高丰度蛋白。

缺点:灵敏度低,产生沉淀物不易剥离再次检测。

显色检测在Western blot中应用的相对较少。


    荧光检测

      通常使用荧光染料(如cy2,cy3等)标记二抗。可以得到直接的信号,膜上的靶蛋白浓度与荧光信号呈线性关系,实现真实可靠的定量分析。利用不同发射光谱的荧光染料标记不同种属的二抗,可无需剥离,实现一张印迹膜上的多重检测(如图)。


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优点:

1、同一印迹上多重检测;

2、可获得直接信号,线性响应范围更宽,印迹重复性好;

3、归一化更简单。

缺点:

1、灵敏度较化学发光低;

2、需要带有适合滤光片或激光的成像仪器;

3、需要注意避免荧光污染。

荧光检测由于可获得稳定直接信号,结果可靠、重复性好,在Western blot实验中使用越来越多。


    化学发光

      通常是用HRP标记二抗。HRP作用于化学发光底物(ECL),使其发射425nm波长光,可通过 X 光胶片(如下图)、CCD 成像系统检测。相比其他用检测方法,化学发光的检测灵敏度最高,目前最高检测灵敏度已经达到低飞克(Femto)-高阿克(Atto)级别。化学发光法可实现多次曝光以获得最佳图像;可剥离抗体并重新检测整个印迹膜,以分析另一个蛋白靶点或优化第一个蛋白靶点的检测结果。


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优点:

1、灵敏度高,有多种灵敏度级别的化学发光液可以选择;

2、可剥离重新检测印迹。

缺点:

1、间接光信号,归一化较难,重复性较差。

化学发光目前任然是在Western blot实验中最常用的检测方法。



1

案例一:

    没有信号或者信号很弱

图片


分析:
1、样本:是否降解;是否靶蛋白丰度低难以检测;是否上样量太低;
解决办法:蛋白提取时低温操作,加蛋白酶抑制剂,蛋白保存注意避免反复冻融,防止蛋白降解;提高样品浓度,增加上样量;
2、转膜:是否转膜效率低;
解决办法:优化转膜条件,如增加转膜时间,提高转膜电压/电流,选择合适孔径的膜;
3、显影检测:发光液灵敏度低。
解决办法:选择高灵敏度化学发光液。
2

案例二:

    背景高 条带无信号

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分析:
      HRP酶过量。
注意:HRP酶催化ECL氧化是不可逆的,一旦底物消耗完,信号就终止了。
      另外过多的HRP在某一局部位置时,催化底物反应,会产生大量自由基,自由基会使HRP失活,且会破坏抗体,膜上靶蛋白,阻碍剥离后再次孵育抗体。
解决办法:降低上样量,降低一抗二抗浓度,选择合适的化学发光液。
3

案例三:

    反白 空心带

图片


分析:
      这种情况也是由于HRP酶过量,导致局部底物快速消耗完。
解决办法:降低上样量,降低一抗和二抗的浓度。另外可以选择灵敏度低,信号持续时间久的化学发光液。
4

案例四:

    显影后膜上出现褐色印迹

图片


分析:
      HRP被氧化和失活会呈现黄褐色。HRP酶连二抗中,总有一部分HRP被氧化。但是在优化的体系中,这部分比例极小,所以不会在印迹膜上看到。当印迹膜上,局部有大量的HRP,在催化底物反应时产生大量自由基会使其失活,则会产生褐色印迹。
解决办法:降低上样量,降低一抗、二抗的浓度选择合适的化学发光液。
5

案例五:

    换了高灵敏度发光液 背景很脏

图片


分析:

1、封闭不充分;抗体和封闭液产生交联反应;洗膜不充分;抗体浓度过高。

解决办法:增加封闭时间,优化封闭液浓度;更换其他类型封闭液;增加洗膜次数延长时间;降低抗体浓度。

2、化学发光液:灵敏度高的化学发光液可以检测出更微弱的信号,所以可能导致背景增强。

解决办法:换了灵敏度高的化学发光液,需要适当降低一抗、二抗的浓度。只有当酶和底物达到合适平衡,才能得到更好的信号,以及获得更低的背景。


/ - 小 贴 士 - /

选择一款合适的化学发光液,会让我们的实验事半功倍,那么我们该怎么选择呢?


主要考虑两个因素:灵敏度信号持续时间

      一般来说,相同量的HRP,灵敏度越高的发光液,发出的信号越强,信号持续的时间越短;灵敏度低的发光液反之。

      所以检测表达量高的蛋白,可选择灵敏度低一些的发光液,不容易出现信号消失过快、反白等现象;检测表达量低的蛋白,可选择灵敏度高的发光液,更容易检测出信号。

      另外当我们更换不同灵敏度的发光液时,需要进一步优化我们的体系才能得到更好的结果。







产品内容


货 号产品名称   规 格产品价格
SQ202

Omni-ECL™基础型化学发光检测试剂

(皮克级)

100ML258元
SQ202L

Omni-ECL™基础型化学发光检测试剂

(皮克级)

500ML798元
SQ201

Omni-ECL™超灵敏化学发光检测试剂盒

(飞克级)

100ML798
SQ201L

Omni-ECL™超灵敏化学发光检测试剂盒

(飞克级)

500ML3198元





产品特点

g

图片 高灵敏度 —— 快速检测低至皮克量/飞克量的蛋白,性能明显优于同级别其它高 端品牌产品;

图片 高性价比 —— 与其它同级别化学发光底物相比,性价比极高。


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