海星生物：细胞复苏培养实验步骤与注意事项

细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。

避免温度变化：在复苏过程中，应尽量避免温度的剧烈变化，以免对细胞造成额外的压力。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

        （2) 管内冻存液融化至只剩一个约2 mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次，转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

注意：此时细胞比较脆弱，细胞膜表面还未完全恢复，剧烈的吹打会造成细胞活率下降。因此，需要以轻柔的方式稀释细胞冻存悬液。轻柔颠倒混匀，充分稀释冻存液，有条件可以静置1分钟，使细胞恢复渗透压，再进行下一步操作。

常见培养器皿底面积和加液量参考

注意：添加培养液体积和胰酶添加量仅供参考，特殊细胞可适当进行调整。

注意：贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动。

1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套，护目镜。如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。

2. 细胞放入水浴中复苏时注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。

4. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。

5. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染，实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除。

1. 细胞复苏后，细胞数量很少

可能得原因：细胞冻存前活细胞少，状态不佳；细胞解冻速度过慢；细胞冻存悬液在常温下时间太久；未充分稀释冻存液；离心速度不恰当。