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愚公生物:耐盐DNase I-ST——高效去除IVT产物中的DNA

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发表时间:2024-05-24 13:28作者:诺扬生物来源:愚公生物

耐盐DNase I-ST


高效去除IVT产物中的DNA



mRNA疫苗生产过程中,以DNA为模板通过体外转录反应 (IVT) 获得mRNA后,需要及时去除残留的DNA模板,以避免后续造成不良影响。经典策略是使用DNase I降解DNA,但常规DNase I还存在两个问题:


(1)耐盐性差

DNase I在含有Ca2+与Mg2+且不含其他盐离子的缓冲液中才具有最高活性,而溶液中Na+浓度提高到30 mM以上就会抑制DNase I活性。体外转录所使用的T7 RNA聚合酶缓冲液、NTPs等原料往往含有一定浓度的Na+,虽然一般DNase I的用量都是远远超过降解DNA模板所需用量,但盐离子仍然可能会使DNase I反应效率不稳定,导致降解不彻底。


(2)DNA亲和力偏弱

常规DNase I与DNA的亲和力偏弱,对低浓度DNA切割效率不足。随着反应进行,DNA浓度逐渐降低,最后剩余的DNA无法彻底清除。


针对上述问题,愚公生物通过蛋白质理性设计改造(发明专利申请中),在野生型DNase I基础上获得了新型耐盐DNase I-ST产品。


DNase I-ST大幅增强了与DNA的亲和力,不仅提高了盐离子耐受性,还提升了降解低浓度DNA的效果,对于从体外转录产物中彻底去除DNA而言尤为重要。


耐盐性好

如图所示,与野生型相比,2U DNase I-ST在300 mM的NaCl浓度下仍能基本完全消化1 μg质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳基本无可见条带。

DNase I-ST与野生型DNase I的耐盐性对比


DNA降解效率高

分别使用不同厂商的IVT反应体系(盐浓度不同),在20 μl反应体系中同样以1 μg线性化质粒DNA为模板完成体外转录,然后分别加入2 U DNase I(3种耐盐型、1种野生型)在37℃处理15 min。处理后的RNA产物经过柱纯化回收后,使用探针法qPCR检测DNA残留水平。每个样本的平均Ct与标准曲线进行比较,确定残留DNA的量以及去除百分比。


结果可见,无论是在盐浓度较低的体系1,还是盐浓度偏高的体系2中,愚公DNase I-ST去除DNA的倍率都远高于野生型,也显著高于友商竞品,能够更彻底地去除体外转录体系中残留的DNA模板,保证mRNA产物的纯度。


愚公DNase I-ST特点

01

DNA亲和力大幅提升,催化效率更高

02

耐盐性好,在含有300 mM盐的溶液中仍能高效降解DNA

03

重组表达,无RNase污染

04

尤其适合清除体外转录反应后的DNA模板

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