MagCaptureTM 外泌体分离试剂盒 常见问题

•　关于试剂盒的规范、性能

Q1　本试剂盒使用了抗体吗？

Ａ1　没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷脂酰丝氨酸（PS）结合的蛋白。

Q2　用此款试剂盒可提取什么样的细胞外囊泡呢？

Ａ2　外泌体和大型细胞外囊泡（微小泡）。

Q3　外泌体和微泡的区别是？

Ａ3　外泌体，是来源于晚期胞内体，直径为40-100nm的细胞外囊泡。微泡来源于细胞膜，直径100-1000nm的细胞外囊泡。

Q4　外泌体和微泡能可以分别纯化吗？

Ａ4　可以。同时纯化的情况下，1200×g离心取上清液。纯化外泌体的情况下，10000×g离心取上清液。只纯化微泡的情况下，10000×g离心，沉淀置于TBS制成悬浊液备用。样品的前处理请参考操作说明书。

Q5　外壳型病毒也能回收吗？

A5　能。外壳性病毒膜表面也有PS，混入外壳性病毒的样品，所有PS都能回收。需要分离的情况下，使用本试剂盒回收后，需要用与病毒或者外泌体特异性抗原的抗体纯化。

Q6　所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸（PS）吗？

A6　尚未得到实验验证。通过分析外泌体的膜脂成分证实，有几种细胞（小鼠少突胶质细胞）来源于外泌体。因此，不会暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌体，而此款试剂不能纯化这种外泌体。

Q7　该试剂盒的样品是什么？

A7　使用细胞培养上层清液、血清或尿液效果显著。如果血浆中添加了螯合剂（比如EDTA）和柠檬酸，原理上无法分离外泌体。由于肝素处理过的血浆回收率低，从血液样本中回收请使用血清。

Q8　一次能回收多少外泌体？

A8　根据样品的种类和数量有很大的差异，据研究所实验记录，在一次的分离中最多能回收30μg蛋白质（通过BCA法检测）、1-2×10¹⁰粒子（通过纳米技术检测）。（K562培养基中的莫能菌素能促进外泌体分泌，可取5mL培养上清液进行回收）。

        1 mL正常人混合血清能回收5×10⁹颗粒（通过纳米技术检测）。

•　与传统法的比较

Q9　与超速离心法相比好处在哪？

A9　与超速离心法相比，本试剂盒能更简便、重复性好、高效地回收高纯度外泌体。也能回收超速离心法无法沉淀的外泌体。

Q10　与传统抗体亲和法相比，PS亲和的优势是什么？

A10　采用传统的抗体亲和法是用变性剂进行洗脱，此款试剂盒是在中性环境下用螯合剂来洗脱的，能完整回收外泌体，不会混入非特异性吸附物，能获得高纯度外泌体，提取纯度更高。传统的抗体亲和法只能特异性识别一种外泌体表面Marker蛋白质，而本试剂盒是特异性识别膜脂质成分，更能广泛获得外泌体。有事例表明识别表面Marker蛋白质抗体不能识别不同动物物种的抗原，而本试剂盒能在大范围的动物物种中运用（人，小鼠，牛等都有报道）。

Q11　与其他方法相比回收的纯度如何？

A11　与传统沉淀法（超速离心法、多聚物沉淀法）相比，纯度更高。与超速离心法和密度梯度离心法相结合的方法相比，能简便地获得同等高纯度的外泌体。

Q12　与其他方法相比回收率如何？

A12　与采用抗体的传统亲和法、超速离心法相比，能获得更高的回收率（低于聚合物沉淀法）。

•　关于试剂盒的操作方法、组成

Q13　操作该试剂盒耗时多久？

A13　（1个小时预处理样品），该试剂盒Exosome Capture 磁珠的固定需要15分钟，然后3个小时的化学反应，最后15分钟洗脱，总计3小时30分钟。

Q14　本试剂盒需要特别慎重的操作吗？

A14　Exosome Capture 固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。提取时在提取液中加入磁珠后，确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。

Q15　提取液的组成有哪些？

A15　是含有1mM 的螯合剂、盐、防腐剂的Tris基础溶液。若以上成分阻碍后续分析，请使用超滤膜（Sartorius公司   VivaSpin500，使用100K分子量截留，Code：VS0141）并替换合适的Buffer。

Q16　Exosome Capture 固定后磁珠可以循环利用吗？

A16　可以。为了能够高效回收样品中的外泌体，试剂盒可完成5次回收实验。试剂盒里的缓冲液只含5次纯化的量。1mL体积以上样本建议进行浓缩后再回收，纯化时可进行反复抽提，提高纯化效率。详情参考操作说明书。

Q17　Exosome Capture 固定化磁珠能保存吗？

A17　可以。洗脱出外泌体后的磁珠需再使用，用试剂盒附带的 Washing buffer 或自制的TBS冷藏保存。

Q18　实验要留到第二天需要做什么步骤？

A18　Exosome Capture 固定化磁珠与样品的反应步骤（反应时间3小时）可以过夜。

•　关于样品用量

Q19　样品纯化所需的最低量是？

A19　使用旋转器的需要500μL以上，使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后再使用Exosome Capture 固定化磁珠。

Q20　大量的样品能回收吗？

A20　可浓缩后再回收。如果样品是培养上清，可以从体积50毫升的样品中回收外泌体。离心分离预处理后，取50mL上清液超滤浓缩至1mL（推荐Sartorius Viva Spiｎ20 使用100K分子量截留、Code：VS2041）。无血清培养基和添加了10% FBS的培养基也可以收集外泌体。详情参照操作说明书。因为血清样品无法浓缩，最多只能用１０ｍL的样品。但是大于1mL的血清回收率低，建议反复提纯。

•　关于外泌体提取后的分析

Q21　外泌体中含有什么？

A21　含有蛋白质、脂质、核酸（DNA、microRNA、mRNA）等。

Q22　提取后的细胞外囊泡可以用什么方法检测？

A22　因为能得到完整的细胞外囊泡，可以使用所有的分析方法。

         （例）蛋白质分析：蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA等；

      核酸分析如：定量PCR、微阵列（生物芯片）、新一代测序等；

      粒子分析：电镜分析，纳米位点分析（NTA）等；

      功能分析：体内外的用药实验等。

Q23　提取后的细胞外囊泡（EVs）能直接添加到细胞使用中吗？

A23　可以使用，但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影响，参考Q15替换合适的Buffer。使用离心过滤部件（Millipore 公司ΜLtrafree - MC， GV 0.22μm 已灭菌、Code：UFC30GV0S）除菌。

Q24　电镜分析需要外泌体的量是多少？

A24　能用电镜观察到2-4×10¹⁰的粒子（通过纳米技术检测）。

Q25　提取出的细胞外囊泡的保存条件是？

A25　冷藏、冷冻保存。长期保存需要放到-80℃。

          为避免冻结溶解，冻结保存推荐细分后保存。

Q26　如何做回收的外泌体提取液的免疫印迹？

A26　本公司研究所从回收的100 μL提取液抽取15 μL，加入5 μL 4×SDS样品Buffer，共20μL的样品全量上样进行 SDS-PAGE。用量与宣传册上的免疫印迹的样本量一致。

•　关于外泌体标记

Q27　用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢？

A27　根据表面抗原的抗体（WB）、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量等来验证。

Q28　外泌体分离后用免疫印迹法确认的标记蛋白是什么？

A28　CD9， CD63， CD81， Frotillin-2， Lamp-1等。

•　相关产品

Q29　有在销售和光检测外泌体用的抗体吗？

A29　本公司当前销售以下抗体。

          Ancell公司 白细胞分化抗原9 (人), 单克隆抗体 (SN4) (生物素标记) 产品编号：ANC-156-030

          Ancell公司 白细胞分化抗原63 (人), 单克隆抗体 (AHN16.1) (R-藻红蛋白标记) 产品编号：ANC-215-050

          Ancell公司 白细胞分化抗原81 (人), 单克隆抗体 (1.3.3.22) 产品编号：ANC-302-020

Q30　有可以从分离囊泡里提纯RNA的试剂盒吗？

A30　有。可使用microRNA Extractor SP Kit（295-71701）比AGPC法更能高效提纯RNA。

Q31　有销售磁支架吗？

A31　没有。使用 Thermo Scientific公司 DynaMag-2（12321D）等。