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Western Blot 蛋白免疫印迹常见问题汇总分析

发布时间:2019-06-05

 电泳中的问题
 出现问题 原因
 条带呈笑脸状(︶) 凝胶不均匀冷却,中间冷却不好
迁移过快,电泳系统温度偏高
 条带呈皱眉状(︵) 可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡或者凝胶两边聚合不完全
 拖尾 样品溶解不好
 纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒,电泳前将样品离心去除颗粒
 条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜
 条带两边扩散 加样量过多
    
 Western blot结果中背景高且不均匀
 可能的原因 建议
 抗体浓度太高 一抗或二抗浓度太高会导致高背景,增加抗体稀释倍数
 一抗孵育的温度偏高 建议4℃结合过夜
 使用的封闭液不兼容 对比不同的封闭缓冲液
 非特异性位点封闭不足 优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性;
提高封闭液中蛋白的浓度;
优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1h或者4°C封闭过夜;
在封闭液中加入Tween-20,Tween-20的终浓度为0.05%。
 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 换一种不同的封闭液;
不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素;
交叉反应的检测:封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测。
 洗膜不充分 降低HRP结合物的浓度;
增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积;
如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%。
 膜在实验过程中干过 实验过程中要注意保持膜的湿润
 选择的膜容易产生高背景 一般硝酸纤维素膜(NC)的背景会比PVDF膜低
 膜的曝光时间过久 缩短印迹膜曝光到胶片的时间
在孵育过程中始终进行震荡
 膜被污染 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合
不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子
 缓冲液污染或结块沉淀 制备新的缓冲液
 HRP处产生聚集体 用0.2μm过滤器过滤结合物
 结合可产生斑点 用一种新的高质量的结合物
 缓冲液中有污染 使用新的缓冲液
缓冲液使用前过滤
 操作设备被污染 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物
保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景
    
 Western blot结果中信号弱或无信号
 可能的原因 建议
 蛋白未转到膜上 转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率(注:总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原);
确保转膜过程中胶与膜完全接触;
确保转印夹层排布正确;
确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜;
确保转印部件在电印迹过程中未过热;
使用正对照和/或分子量Marker;
可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流优化转印时间和电流。
 蛋白未完全结合到膜上 在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。
 一抗、二抗等不匹配 订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物;
可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。
 一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度;
延长抗体孵育时间;
抗体与靶蛋白的亲和力可能很小;
抗体可能失活;可用斑点印迹检测其活性。
 一抗或/和二抗浓度太高 使用太多一抗或二抗可能导致底物迅速耗竭,呈现出很弱的信号
至少成倍稀释一抗/二抗(可4-10倍)
 一抗失效 使用有效期内的抗体,分装保存,避免反复冻融取用,工作液现用现配
 一抗孵育时间不足 建议4℃结合过夜
 抗体不能识别测试种属的相关蛋白 购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
 过度封闭 使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液;
试用不同的封闭液;
减少封闭时间。
 洗膜过度 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20
 缓冲液中含有叠氮钠 叠氮钠是一种HRP的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂
 曝光时间太短 延长胶片的曝光时间(注意:超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时)
 底物孵育时间太短 在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育
 酶或底物失活 超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月,超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月;
为衡量底物的活性,准备一个小量的工作液在一个暗室内,加入少量的HRP结合物,会观察到绿光。如果未检测到光,底物或HRP结合物均有可能失活;
确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降。
 膜可以修复剥离重新用探针检测 在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性
优化剥离程序
如有必要可重新用探针检测
避免在同一张膜上重复进行探针检测
 在膜上消解抗原 封闭底物可能含有蛋白水解酶活性(如明胶)
 印迹膜保存时蛋白降解 准备一张新的印迹膜
    
 Western blot结果中杂带较多或特异性条带位置不对
 可能的原因 建议
 细胞传代次数过多,使其蛋白表达模式的分化 使用原始或传代少的细胞株,或平行实验
 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式:乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等,本身可以呈现多条带 查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小
 目的蛋白有其它剪切本 查阅文献或生物信息学分析可能性
 样本处理过程中目的蛋白发生降解 使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂
样本处理时在冰上操作
 上样量过高,太敏感 适当减少上样量
 一抗不纯 使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带
 一抗或者二抗浓度偏高 降低抗体浓度,增加二抗对照
选择特异性更强,只针对重链的二抗
 一抗特异性不高 重新选择或制备高特异性的抗体
 蛋白存在二聚体或多聚体 SDS-PAGE电泳上样前,煮沸10 min,以增强蛋白质解聚变性


 其它现象   
 出现现象 产生原因 解决方案
 膜上多处出现黑点或黑斑 转膜时有气泡或抗体分布不均
抗体与封闭剂结合抗体
 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
过滤封闭剂
 反白(条带显白色) HRP结合物浓度过高 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)
 靶蛋白分子量偏低或偏高 SDS-PAGE胶浓度选择不合适 调整胶浓度,分子量大的蛋白用低浓度胶,分子量小的蛋白用高浓度胶


转膜时需要注意事项
1.采用PVDF膜时,必须先经甲醇激活后才能使用,最好将PVDF膜放置在少量甲醇中浸透1min,再用电转印液漂洗5min,最后浸在电转印液中约30分钟,即可用于转膜
2.接触硝酸纤维素膜、胶和滤纸时,必须戴手套
3.转膜时间不易过长,否则蛋白容易转出硝酸纤维素膜
4.大电流转印时,常常导致电泳液过热现象。故电泳应在具有冷却水循环电泳槽或冰浴内进行
5.将夹子放在转移槽内,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面
  
蛋白质印迹条带大小与预期的不同常见因素
翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等,可增加蛋白质大小。
翻译后切割 - 例如,许多蛋白先被合成为前蛋白,然后被切割产生活性形式,例如前半胱天冬酶。
剪接变体和异形体 - 可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。
相对电荷-氨基酸(带电和不带电)多聚体组分,例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止,但强相互作用会导致较大的条带出现。
  
Western Blot的染色选用
阴离子染料是较常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。
生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。
  
应该上样多少样品
细胞裂解物、膜裂解物和核裂解物:每孔上样 20 至 30 µg 总蛋白。
这可能需要根据测试样品中的蛋白质表达水平进行一些优化。纯化蛋白(重组或内源):上样 10 至 100 ng 蛋白。
  
做200kd蛋白的Western Blot时要注意的点
分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)
  
“短路”现象的产生和处理
如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
  
大分子量蛋白转移效率低的解决方法
可以在转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇能增加蛋白质和NC膜的结合能力,同时可以延长大分子量蛋白质转移时间;
转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也可增加转移效率;
选用优质的转移膜,或者使用0.22um的NC膜;
使用戊二醛交联;
太大时还可以考虑琼脂糖胶;
提高转移电压、电流;
增加转移时间。
  
上样量超载用什么方法来增加上样量
可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的comb。
  
检测重组蛋白时难以获得条带
抗体检测重组蛋白质时,存在难以克服的困难,有必要加以考虑。我们推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。
同时,如果重组蛋白带有标签,标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的C或N末端,以降低这种情况发生的可能性(而不是位于蛋白质的阅读框中间)。
在蛋白质印迹中检测重组蛋白时,我们始终推荐运行内源阳性对照。
  
Western Blot 中抗体的重复应用问题
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。
  
Western是否可以同时加两种或多种一抗
通常情况下只加一种抗体。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗、ECL显色、压片、洗片;漂洗以后再上内对照的一抗、二抗、ECL显色、压片、洗片。



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