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IDT寡核苷酸合成领域的领导者(丹纳赫旗下)----CRISPR/Cas9基因编辑技术

发布时间:2020-06-09

关于IDT(丹纳赫旗下):

       美国Integrated DNA Technologies公司(以下简称IDT)创办于1987年,是寡核苷酸合成领域的领导者,在过去的30多年里IDT致力于为学术研究、农业发展、医疗诊断、药物研发等领域开发和制造核酸产品,IDT可以为客户提供高品质的产品、专业的技术支持和个性化的定制服务。在分子生物学领域,IDT为二代测序、基因编辑、qPCR和RNA干扰等领域开发了一系列专有技术。IDT生产的GMP级别产品被广泛应用于多种癌症以及遗传和感染性疾病的诊断试剂研发,并通过不断优化自动化合成平台的处理技术来加快原研试剂的开发和生产。
       IDT为100多个国家和地区的超过120,000名生命科学研究人员提供服务,每天生产70,000多条核酸产品。IDT针对基因组学应用开发的创新工具和解决方案正在打破研究壁垒,激发您的梦想,实现下一个突破。



※ 专题内容导航


一、CRISPR/Cas9系统介绍
二、CRISPR/Cas9的应用
三、IDT 的 Alt-R® CRISPR/Cas9产品
四、IDT基因编辑相关产品
五、文献引用
六、Alt-R S.p. Cas9、其变体、Cas12a系统(Cpf 1)的比较


一、CRISPR/Cas9系统介绍

       CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。

       Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。


      研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具,又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下,将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化,CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素:Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。


♦ 相关名词解释与作用

CRISPR:成簇间隔短回文序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats);
crRNA: (CRISPR RNA)用于识别基因组序列;
tracrRNA: (trans-acting crRNA)用于招募和激活Cas9;
Cas9蛋白:CRISPR-associated genes家族的一员,用于切割DNA,(CRISPR-associated genes家族,包括Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpfl等。可利用其工作机制切割特定DNA片段,从而进行基因编辑。)


♦ 原理图:


该系统非常高效,因此crRNA只需要最少的设计工作。唯一需要提供的是一个与您靶基因中的PAM(前间区序列邻近基序;NGG)序列紧邻的、具有位点特异性的19或20个碱基的序列。
注:NGG 代表AGG,TGG,GGG,CGG四种可能,满足其中一种即可。

♦ Cas9蛋白、crRNA+tracrRNA的来源和优缺点对比

                   
                                                                                                                                                       Cas9蛋白实现方式及优缺点

Cas9方式

优点

缺点

1、Cas9购买蛋白•最佳方案:高效、稳定、可控、无毒、易转•价格贵,尤其与质粒相比
2、Cas9稳转细胞系表达蛋白•转染比较稳定•商业化细胞系品种很少
•细胞系无法制成
•表达量低
3、mRNA翻译Cas9•在某些系统里表现突出•有毒性
•难以导入到细胞内
4、可以表达Cas9的质粒•价格便宜
•种类多样
•大质粒难以转染
•转染不稳定
5、慢性病毒系统•高效率•耗时长、昂贵、需要专业操作技能
•细胞质持续不断表达
•无法用于治疗用途

      crRNA+tracrRNA的实现方式及优缺点

gRNA方式

优点

缺点

1、化学合成的2-oligo gRNA•表现最好
•低毒性
•添加化学修饰,更稳定
•较贵
2、体外转录sgRNA•易于获得•一般未化学修饰,
•有毒性
•转化效率低
3、自身带有启动子的表达片段•表现良好•不如化学合成有修饰的sgRNA效率高
•有细胞毒性
4、可以转录的RNA质粒•根据参考文献
•价格便宜
•分子克隆步骤繁琐
•合成品质高的质粒价格相对高
•有细胞毒性
•大质粒难转染

         总结:Cas9蛋白与crRNA+tracrRNA都是直接得到最佳!


二、CRISPR/Cas9的应用


♦ CRISPR-Cas9敲除可以替代RNAi方法


主要对比

RNAi干扰

CRISPR-Cas9基因编辑

机制来源来源于真核生物的免疫系统来源于原核生物的免疫系统
作用水平mRNA水平基因组水平
靶位点范围仅转录本所有基因组序列,如外显子、内含子、启动子、增强子、基因间隔序列等
靶蛋白消除水平不完全消除完全消除,部分消除
靶蛋白功能部分丧失完全丧失,部分丧失


♦ 可以参与基因过表达(不额外增加外源基因或者RNA,激发基因本身潜能)


♦ CRISPR文库,可以进行高通量的药物筛选和基因筛选


    Cas9文库筛选的应用扩展

       ☑ 联合用药

           通过小分子药物激活/关闭关键信号通路,提高药效,降低不良反应

       ☑ 其他细胞刺激因素机制研究

           致病病毒、缺氧、氧化压力、酸碱压力、温度、气压等其他影响细胞增殖或凋亡的刺激因素


    全基因组CRISPRS筛选小结

    •传统的药物机制或耐药研究是盲人摸象
    •全基因组筛选对药物作用机制基因或耐药基因一网打尽
    •CRISPRS-Cas9/SAM筛选可以双向筛选(敲除或激活)
    •可以寻找到药物作用所依赖的基因,也可以寻找到耐药基因或药物增敏靶标,联合用药服务临床

三、IDT 的 Alt-R® CRISPR/Cas9产品

1.cas9蛋白(酶)系列产品2.crRNA系列产品3.tracrRNA系列产品4.辅助试剂

1.Cas9蛋白(酶)系列产品

    • 常规Cas9酶,高效率编辑          • 高保真Cas9酶,极低的脱靶率  
     • 特殊Cas9酶,切割单链              • 所有的Cas9酶均已特殊优化

 

⑴ 产品信息:Cas9蛋白(酶)

                                                                                                           
Cas9 D10A 切割酶。切割靶标链1081062Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 100 µg100 µg
Alt-R® S.p. Cas9 D10A 切割酶 V3, 100 µg
1081063Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 500 µg500 µg
Alt-R® S.p. Cas9 D10A 切割酶 V3, 500 µg
Cas9 H840A 切割酶,切割非靶标链1081064Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 100 µg100 µg
Alt-R® S.p. Cas9 H840A 切割酶 V3, 100 µg
1081065Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 500 µg500 µg
Alt-R® S.p. Cas9 H840A 切割酶 V3, 500 µg
Cas9 核酸酶,野生型,高编辑效率1081058Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 µg100 µg
Alt-R® S.p. Cas9 核酸酶 V3, 100 µg
1081059Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3, 500 µg500 µg
Alt-R® S.p. Cas9 核酸酶 V3, 500 µg
高保真 Cas9 核酸酶,保证高编辑效率的同时,降低脱靶概率1081060Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg100 µg
Alt-R® S.p. 高保真 Cas9 核酸酶 V3, 100 µg
1081061Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 500 µg500 µg
Alt-R® S.p. 高保真 Cas9 核酸酶 V3, 500 µg




⑵ 产品信息:参与基因过表达(不额外增加外源基因或者RNA,激发基因本身潜能)

dCas9 蛋白,不产生切割功能,与刺激因子和sgRNA一起,参与基因过表达1081066Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3, 100 µg100 µg
Alt-R® S.p. dCas9 蛋白 V3, 100 µg
1081067Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3, 500 µg100 µg
Alt-R® S.p. dCas9 蛋白 V3, 100 µg


2.crRNA系列产品+3.tracrRNA系列产品


crRNA,crRNA XT, tracrRNA,sgRNA 四类产品可以选择
注:sgRNA 全称single guide RNA(单导向RNA) 由两部分组成:crRNA+tracrRNA

注:IDT的crRNA长度36bp,野生型为42bp,IDT的tracrRNA长度67bp,野生型为89bp,IDT的sgRNA长度100bp,野生型为131bp,IDT可以做到更短的片段更高的编辑效率。

⑴ 产品信息:
                                                                                                                     
Cas9 crRNA XTAlt-R CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol10 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol, Plate10 nmol, Plate
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol2 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol, Plate2 nmol, Plate
Cas9 crRNAAlt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol10 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol, Plate10 nmol, Plate
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol2 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol, Plate2 nmol, Plate
Cas9 sgRNAAlt-R CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol10 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol, Plate10 nmol, Plate
Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA, 100 nmol100 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol2 nmol
Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol, Plate2 nmol, Plate
Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA, 50 nmol50 nmol
Cas9 tracrRNA,序列固定,不需要定制,直接商品化产品1072534Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, 100 nmol100 nmol
1072533Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol20 nmol
1072532Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, 5 nmol5 nmol



⑵ 产品信息 :IDT可以对tracrRNA进行ATTO 550荧光标记

Cas9 tracrRNA, ATTO™ 5501075928Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 20 nmol20 nmol
1075927Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 5 nmol5 nmo

⑶ Cas9相关对照产品
                                                                                                                      
Cas9 HPRT 阳性对照1072541Alt-R® Cas9 HPRT Positive Ctrl crRNA Human, 2 nmol2 nmol
Alt-R® Cas9 HPRT 阳性对照 crRNA 人,2 nmol
1072542Alt-R® Cas9 HPRT Positive Ctrl crRNA Mouse, 2 nmol2 nmol
Alt-R® Cas9 HPRT 阳性对照 crRNA 小鼠,2 nmol
1072571Alt-R® Cas9 HPRT Positive Ctrl crRNA Rat, 2 nmol2 nmol
Alt-R® Cas9 HPRT 阳性对照 crRNA 大鼠,2 nmol
Cas9 阴性对照1072544Alt-R® Cas9 Negative Control crRNA #1, 2 nmol2 nmol
Alt-R® Cas9 阴性对照 人 crRNA #1, 2 nmol
1072545Alt-R® Cas9 Negative Control crRNA #2, 2 nmol2 nmol
Alt-R® Cas9 阴性对照 小鼠 crRNA #2, 2 nmol
1072546Alt-R® Cas9 Negative Control crRNA #3, 2 nmol2 nmol
Alt-R® Cas9 阴性对照 大鼠 crRNA #3, 2 nmol
HPRT PCR引物混合物1072551Alt-R® HPRT PCR Primer Mix, Human, 2 nmol2 nmol
Alt-R®HPRT PCR引物混合物,人,2 nmol
1072552Alt-R® HPRT PCR Primer Mix, Mouse, 2 nmol2 nmol
Alt-R®HPRT PCR引物混合物,小鼠,2 nmol
1072553Alt-R® HPRT PCR Primer Mix, Rat, 2 nmol2 nmol
Alt-R®HPRT PCR引物混合物,大鼠,2 nmol
Cas9对照试剂盒(包含• Alt-R CRISPR HPRT阳性对照 crRNA
• Alt-R CRISPR阴性对照 crRNA #1
• Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA
• Alt-R HPRT PCR Primer Mix
• Nuclease-Free Duplexing Buffer
1072554Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human, 2 nmol2 nmol
Alt-R®CRISPR-Cas9对照试剂盒,人类,2 nmol
1072555Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Mouse, 2 nmol2 nmol
Alt-R®CRISPR-Cas9对照试剂盒,小鼠,2 nmol
1072556Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Rat, 2 nmol2 nmol
Alt-R®CRISPR-Cas9对照试剂盒,大鼠,2 nmol

⑷ 基因组编辑检测试剂盒相关产品

The T7 endonuclease I (T7EI) mismatch cleavage assay detects on-target genome editing and estimates genome editing efficiency in CRISPR-treated cells.
• Straightforward—use standard molecular biology techniques
• Fast—does not require purification of PCR products before analysis
• Consistent—analyze easy-to-read electrophoresis results
• Quantifiable—gel band intensities relate to genome editing efficiency
• Versatile—convenient for a single sample or high throughput analysis in plate format

基因组编辑检测1075933Alt-R® Genome Editing Detection Kit, 100 rxn100 rxn
Alt-R®基因组编辑检测试剂盒,100 rxn
1075932Alt-R® Genome Editing Detection Kit, 1000 rxn1000 rxn
Alt-R®基因组编辑检测试剂盒,1000 rxn
1075931Alt-R® Genome Editing Detection Kit, 25 rxn25 rxn
Alt-R®基因组编辑检测试剂盒,25 rxn


                  试剂盒组分:


Alt-R™ Genome Editing Detection Kit

Kit component*25 rxn kit100 rxn kit1000 rxn kit
T7 Endonuclease I (T7EI, 1 U/uL)50 uL200 uL2000 uL
T7EI Reaction Buffer (1 OX)50 uL200 uL2000 uL
Alt-R™ Control A (template/primer mix)20 uL20 uL20 uL
Alt-R™ Control B (template/primer mix)20 uL20 uL20 uL
*PCR master mix and target-specific primers/probe sets are not included in the kits.
Kit storage conditions: -20°C.
 
⑸ A.s. Cas12a(Cpf1)相关产品信息

Cpf1,与cas9一样,也是CRISPR-associated genes家族的一成员,也是用于切割DNA,cpf1系统不需要tracrRNA,只需要 crRNA与Cas12a(Cpf1)蛋白(内切酶)就可以。
Cpf1 crRNAAlt-R CRISPR-Cpf1 crRNA, 10 nmol10 nmol
Alt-R CRISPR-Cpf1 crRNA, 10 nmol, Plate10 nmol, Plate
Alt-R CRISPR-Cpf1 crRNA, 2 nmol2 nmol
Alt-R CRISPR-Cpf1 crRNA, 2 nmol, Plate2 nmol, Plate
A.s. Cas12a10001272Alt-R® A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg100 µg
10001273Alt-R® A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg500 µg
1081068Alt-R® A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 100 µg100 µg
1081069Alt-R® A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 500 µg500 µg


    IDT 的crRNA和sgRNA特点总结:

   • 更短的序列,更高的效率,更低的毒性。                • 可以做体外验证
   • 形成的RNP,有较强的稳定性,2周不影响酶活       • 添加荧光标记,实时监控
   • 转化方式灵活,可以脂质体转化,也客户电转。


   总结:IDT与传统方式的比较
                                                            
 

IDT Cas9 system

Traditional Lab

gRNA形式

crRNA, tracrRNA 化学合成

体内转录合成 或体外转录合成

gRNA:Cas9蛋白比例

可控

不可控

转化方式

脂质体、电转、显微注射

脂质体,电转

转化效率

低(大质粒)

细胞内有效RNA浓度

转化之前就定量 真正发挥功能的复合体的量

是否表达,表达量无法确定

编辑效率

效率高,与Cas稳转无显著差别

编辑效率低

流式细胞仪兼容

ATTO-550 标记 tracrRNA 后兼容

兼容

阳性细胞系筛选

ok

no

转化后快速检测转化效率

ATTO-550 标记 tracrRNA 后兼容

no

毒性-RNA

长链RNA激活体内免疫反应

毒性-Cas9

极低,转化后的Cas9会在48小时左右降解

阳性line中,表达量很高,降解周期长


4、辅助试剂

⑴ Purified carrier DNA,通过电穿孔提高Cas9核糖核蛋白(RNP)的递送。专门设计来避免与人类、小鼠和大鼠基因组的同源性
Cas9电穿孔增强剂1075916Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer, 10 nmol10 nmol
Alt-R®Cas9电穿孔增强剂,10 nmol
1075915Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer, 2 nmol2 nmol
Alt-R®Cas9电穿孔增强剂,2 nmol
Cpf1电穿孔增强剂1076301Alt-R® Cpf1 Electroporation Enhancer, 10 nmol10 nmol
Alt-R®Cpf1电穿孔增强剂,10 nmol
1076300Alt-R® Cpf1 Electroporation Enhancer, 2 nmol2 nmol
Alt-R®Cpf1电穿孔增强剂,2nmol

⑵ 小分子化合物,可以提高同源定向修复的比率

HDR增强剂1081072Alt-R® HDR Enhancer, 100 µL100 µL
Alt-R®HDR增强剂,100 µL
1081073Alt-R® HDR Enhancer, 500 µL500 µL
Alt-R®HDR增强剂,500 µL

⑶ Provides constitutive expression of Cas9 under CMV promoter control. Each item contains 1 µg of plasmid.

Cas9表达质粒1072566Alt-R® S.p. Cas9 Expression Plasmid 
Alt-R®s.p. Cas9表达质粒

四、IDT基因编辑关联产品

1.ultramar合成

(具备生产200bases单链的能力)

2.HDR Donor Oligos

专有的修饰来合成以增加donor oligo的稳定性,从而提高基因组双链断裂后成功组合进基因组的机会。)

3.Custom Gene Synthesis(人工基因定制合成服务,专有的gBlocks®和Ultramer® 合成技术)

4.gBlocks Gene Fragments

(125-3000bpDNA双链分子片段)

5.gBlocks Gene Fragment Libraries

(一次合成,可生成多达数十万的构建变体)

6.Megamer Single-Stranded DNA

(可合成201-2000bp ssDNA)


1.Ultramar® 合成

IDT 采用专利耦合技术,Ultramer® DNA 合成的耦合效率在行业中领军首位,具备生产长达200 bases 单链DNA 的能力。每条Ultramer® DNA 序列都会通过ESI-MS 进行质检。

图. 耦合效率决定序列合成终产物全长序列的比例、如上图所示,Ultramer® 优势在合成长序列时尤为明显。合成200个碱基的序列时,在耦合效率为98.5%的工业标准下,正确合成全长产物比例仅为5%;而耦合效率为99.5%(Ultramer® 技术)时约高达38%。高耦合效率可以保证完整准确的全长序列。
                                                                                                                     

Ultramer DNA Oligo

Ultramer RNA Oligos

合成规格及产量,干粉状态交付,或者PH8的缓冲液交付粉状态交付,或者PH8的缓冲液交付.
4 nmole Ultramer® DNA Oligo    45 - 200 basesUltramer® RNA Oligo, 4 nmol 60 - 120 bases
Ultramer® DNA Oligo, 20 nmol   45 - 200 basesUltramer® RNA Oligo, 20 nmol 60 - 120 bases
PAGE Ultramer® DNA Oligo      45 - 200 basesUltramer® RNA Oligo, 80 nmol 60 - 120 bases
应用:应用:
•用于定点突变的对照。•CRISPR的RNA(crRNA+tracrRNA+sgRNA)
体外转录RNA的模板•长的RNA用于RNA药物的研发
•qPCR的标准品•PCR和qPCR的RNA对照
•CRISPR的HDR修复模板 

2. HDR Donor Oligos

lt-R™ HDR Donor Oligos旨在最大化的增加在基因组编辑实验中homology-directed repair(简称HDR,是细
胞内一种修复DNA双链损伤的机制)的修复率。
这些定制的产品会利用专有的修饰来合成以增加donor oligo的稳定性,从而提高基因组双链断裂后成功组合进基因组的机会。


• 最长200个碱基
• 经过修饰的单链DNA donor oligo
• 3-5天即可发货
• 两种规格可选 2 nmol 或者 10 nmol(可根据客户要求提供大包装)

IDT同样会在网站上发布新的HDR设计工具。工具能够提供多种不同的输入方式用于选择需要编辑的靶标基因组序列,工具包含一个直观的界面,可在编辑区域内进行所需的序列编辑。一旦研究者提供编辑内容及编辑位点的详细说明,这个工具将会提供推荐的CRISPR-Cas9 guide RNAs 和相应的HDR donor oligos。在重新核查后,客户可以轻松下单,并且能够根据需求创建新的基因组变更项目。HDR设计工具同样支持适用于更长基因组变更的Megamer单链DNA片段的订购。

HDR Donor OligoAlt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol10 nmol
Alt-R HDR供体寡聚体,10nmol
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol, plate10 nmol, Plate
Alt-R HDR供体寡聚体,10nmol,plate
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol2 nmol
Alt-R HDR供体寡聚体,2nmol
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol, plate2 nmol, Plate
Alt-R HDR供体寡聚体,2nmol, plate

3. Custom Gene Synthesis

IDT提供高质量的、序列经验证的人工基因定制合成服务。定制基因和MiniGene™合成基因使用gBlocks®Gene Fragments或Ultramer® DNA Oligos构建,同时配以全面质控以确保基因序列的准确性。

质量控制和序列验证
定制基因和MiniGene™基因产品的全部插入片段均在两条链上进行序列验证。通过Sanger测序进行序列验证;某些情况下,使用MiSeq®系统(Illumina)测序替代Sanger测序。一般情况下,质控结果包括色谱图、质粒图谱和FASTA文件。IDT的基因合成产物终都以质粒形式交付,这个克隆载体可以直接转化到大肠杆菌中。 为了优化生产和交付时间,长度≤5kb的合成基因均插入含有筛选标记的载体,用户可根据需要选择Amp或Kan抗性。 接收到基因产物后,可以使用很多方法将基因序列亚克隆到其他载体中。克隆载体的序列和插入位点等信息在随货文件中可见。

可应用于
· 蛋白表达
· miRNA 基因
· IVT模板
· 基因变异和SNP分析

基因编辑相关的周围产品
 
· 合成基因可选载体

载体

载体大小

筛选标志

应用

pUCIDT(Amp)

2752

AmpicillinCloning
pUCIDT(Kan)

2705

KanamycinCloning
pIDTSmart(Amp)

2056

AmpicillinCloning
pIDTSmart(Kan)

1932

KanamycinCloning
Pbridt

3170

AmpicillinCloning

产品信息

产量

长度

Custom genes MmiGene 25-500 bp4ug purified plasmid DNA25-500
Custom genes Gene 501-1500 bp4ug purified plasmid DNA501-1500
Custom genes Gene 1501-3000 bp1501-3000
Custom genes Gene 3001-5000 bp3001-5000
Custom genes Gene 5001+ bp1ug in BAC5001+

可能影响合成、组装或测序结果的情况如下
•二级结构:>10个碱基的发夹结构和富含G / C的二级结构
•重复序列和同聚序列:长重复序列,G / C>10个碱基,或A/T>30个碱基
•总体GC含量>65%,区域GC含量<25%
• 限制性位点重复和Dam / Dcm甲基化位点均可能干扰限制内切酶酶切

4. gBlocks Gene Fragments

gBlocks基因片段是经过序列验证的,长度为125-3000 bp的双链DNA分子片段,采用IDT的Ultramer®DNA Oligos合成技术。具有高准确性、高性价比和应用灵活等特性。

质量控制和序列验证
•通过毛细管电泳( Capillary Electrophoresis ,CE)验证片段长度。
•通过质谱(Mass Spectrometry )鉴定序列。
•在多数情况下,每个gBlocks基因片段重组克隆测序后, 80%*之上的克隆都包含期望的插入片段。
* 如果序列非常复杂,其保真度可能会降低。可以通过适当增加测序的克隆数目来获得序列正确的插入片段

         可应用于:
           •基因构建和修饰
           •CRISPR的基因&转录形成sgRNA
           •qPCR或PCR的标准品或内参
           •抗体研究,例如制备重组抗体
           •酶工程
           •疫苗研究


5、gBlocks Gene Fragment Libraries

IDT提供含有mixed base的251-500bp的基因片段库,其优势在于:
•可以接受的成本生成多达数十万的构建变体。
•可以自由选择克隆载体与克隆方法,包括Gibson Assembly®方法和平端或黏末端等克隆方案,实现轻松组装

产品详情

合成251-500bp中允许出现1-8个随机碱基“N”的出现。注:N代表A,T,G,C任意一个碱基。
6、Megamer Single-Stranded DNA

IDT提供长度为201-2000个碱基的Megamer ssDNA片段,Megamer ssDNA经克隆纯化的DNA生成,因而纯度特别高

         可应用于:
            · CRISPR介导的基因编辑的同源重组(HDR)
            · 体外转录(IVT)等应用中。

Megamer Single-Stranded DNA Fragments (paired)互补对Megamer Single-Stranded DNA Fragments (individual)单链
包括ssDNA偏殿和互补链,两条分管交付
干粉运输
终产量校准至3ug
仅有ssDNA片段,没有互补链
干粉运输
终产量校准至3ug

五、使用文献

1.Vakulskas CA, Dever DP,  et al. (2018) A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells
Nat Med. 24:1216- 1224. doi: 10. 1038/s41591-018-0137-0.
2.Park SH, Lee CM, et al. (2018) Highly efficient editing of the beta-globin gene in patient derived
hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Blood, 132(Suppl 1),2192. doi: 10. 1182/blood-2018-99-l 17371.
欲了解更多信息,请访问
www.idtdna.com/CRISPR-Cas9.

六、Alt-R S.p. Cas9、其变体、Cas12a系统(Cpf 1)的比较

Alt-R S.p. Cas9核酸酶与其变体的比较

CRISPR基因组编辑的比较:Cas9系统vs. Cas12a系统(Cpf 1)

注:* Alt-R核酸酶的分子量    N = 任意碱基;V = A、C、或G






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