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MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS[Wako]

发布时间:2018-04-20


MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS


     MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸(PS)亲和Tim4蛋白固化磁珠(PS亲和法)的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高纯度的外泌体,请使用10,000×g离心后的上清。

  该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来,所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验,包括电镜分析(TEM)、纳米粒子追踪(NTA)分析、投喂实验、分子组成(蛋白质、脂质、核酸等)分析等。



细胞膜表面磷脂酰丝氨酸的亲和方法


Tim4蛋白固化磁珠,在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱,捕获高纯度的完整细胞外囊泡


◆优点・特色



使用新型亲和纯化方法 



无需进行超滤

● 使用磁珠改进了操作

● 流程优化

※ 高重复性     


样品类型:细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。


● 可以纯化高纯度完整的细胞外囊泡

● 可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

● 重复性高,回收量稳定

● 简易操作(约3.5小时)

● 启用多个样品(无需超速离心)


产品列表

                                                                                                                  

产品名称

包装规格

保存条件

MagCapture™

10次

2次

2-10°C

Exosome Isolation Kit PS

(产品编号:293-77601

(产品编号:299-77603

试剂盒成分<10 次><2 次>
(1) 链霉亲和素磁珠 600 μL×1 管 120 μL×1 管
(2)生物素标记的外泌体捕获 100 μL×1 管 20 μL×1 管
(3)外泌体捕获免疫固定缓冲液 35 mL×1 瓶 7 mL×1 瓶
(4)外泌体结合增强剂(×500) 500 μL×1 管 100 μL×1 管
(5)洗涤缓冲液 75 mL×2 瓶 30 mL×2 瓶
(6)外泌体洗脱缓冲液 5 mL×1 瓶 1 mL×1 瓶
(7)反应管 22 管 1 管


 *每套试剂盒能完成5次回收实验,即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit


案例•应用


从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析


从人血清中提取外泌体的产量比较

  使用该试剂盒,超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体,接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。


● 检测抗体

      抗CD9兔多抗,System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗,System Bioscience公司

● 免疫印迹(WB)数据

      各样品结果相当于150μL的血清样本。从100μL提取物中取出15μL,添加5μL的4×SDS样品缓冲液,全部上样。

 

从人EDTA血浆中提取外泌体

  分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆(超滤更换缓冲液)、人血清中提取外泌体,进行WB检测(抗Flotillin2抗体)。


● 检测抗体

      抗Flotillin-2小鼠单抗(29/Fotillin-2),BD Bioscience公司

● 使用样品量

      各1mL

● 免疫印迹(WB)数据

      各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL,添加5μL的 4×SDS样品缓冲液,全部上样。


从人尿液中提取外泌体的回收量比较

  1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收,并做免疫印迹(WB)检测(抗CD9抗体)。


● 检测抗体

      抗CD9兔多抗,System Biosciences公司

● 使用样品量

      各1mL

● 免疫印迹(WB)数据

      各样品结果分别对应150μL尿液样品。从100μL提取物中取出15μL,加入5μL的 4×SDS样品缓冲液,全部上样。


◆与传统沉淀法的功能比较实验


  分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562(人慢性骨髓性白血病)细胞培养上清(无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基)提取外泌体,分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。


MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】


  按照试剂盒的操作说明(反应时间:3小时),从1mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)中提取外泌体。

超速离心法

  将10mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)进行超离(110,000×g,70min),用TBS缓冲液重悬沉淀物后,再进行超离(110,000×g,70min),回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

  从1mL经过离心处理(10,000×g,30min)的K562细胞培养上清(无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1)中,按照市售的A公司产品的操作说明(静置时间:过夜)提取外泌体。

※1:110,000×g离心2小时,在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比较提取的外泌体的透射电子显微镜(TEM)分析结果和纳米粒子追踪(NTA)分析结果

  分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体,用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外,用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段(2~4×1010 particles),在透射电子显微镜进行分析。


5.png

电子显微镜图像 数据提供:金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生


MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子,在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

 

K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较(无血清培养基)

  用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清(无血清培养基)获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法(CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体)进行实验。



6.jpg


6.5.jpg

回收量,不是回收率

● 检测抗体

     抗CD63小鼠单抗(MEM-259)

     抗Flotillin-2 小鼠单抗  (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗 (25/Lamp-1),BD Bioscience公司

 

K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较(10%FBS-添加培养基)


  用MagCapture™外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法,从K562 细胞培养上清(10% 去外泌体 FBS补充培养基)获得样品进行电泳,用银染法和WB法(CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体)进行实验。同时,对外泌体提取片段进行质谱测定,比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例(由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的,所以人来源多肽的比率会下降)。


7.png


● 检测抗体

     抗CD63小鼠单抗(MEM-259)

     抗Flotillin-2小鼠单抗 (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司

     健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较


实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量

通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离,然后使用microRNA提取试剂盒(产品编号295-71701)提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA,并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。


8.png

相比超离法,PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。


②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较

  运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离,然后使用microRNA提取试剂盒(产品编号295-71701)或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA,并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。


9.png

对比AGPC法,使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA


◆外泌体蛋白质组学分析


<实验内容及结果>

  分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法,从含10% FBS(不含外泌体)的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离,剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化,用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质

白色柱:源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱:来自FBS的牛蛋白污染物

红 色:来自外囊泡的标记蛋白

样品:K562细胞培养基(含有10%去除外泌体胎牛血清)


 

PS亲和法

超离法

聚合物沉淀法

1

71kDa热休克同源蛋白 DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因 补体C3
(Heat shock cognate 71kDa protein) (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) (Complement C3)

2

膜联蛋白A6 铁转蛋白受体1 α2-巨球蛋
(Annexin A6) (Transferrin receptor protein1) (Alpha-2-macroglobulin)

3

铁转蛋白受体1 血清白蛋白 纤连蛋白
(Transferrin receptor protein1) (Serum albumin) (Fibronectin)

4

V-ATP酶A亚基 ATP依赖RNA解旋酶 血清白蛋白
(V-type proton ATpase catalytic subunit A) (ATP-dependent RNA helicase A) (Serum albumin)

5

浮舰蛋白-2 微管蛋白β5 血小板反应蛋白-1
(Flotillin-2) (Tubulin beta-5 chain) (Thrombospondin-1)

6

程序性细胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein) 71kDa热休克同源蛋白 补体C4
(Heat shock cognate 71kDa protein) (Complement C4)

7

细胞表面抗原4F2重链 脂肪酸合成酶 α-1抗蛋白酶
(4F2 cell-surface antigen heavy chain ) (Fatty acid synthase) (Alpha-1-antiproteinase)

8

膜联蛋白A1 细胞表面抗原4F2重链 载脂蛋白-β-100
(Annexin A1) (4F2 cell-surface antigen heavy chain) (Apolipoprotein-β-100)

9

220kDa激酶D相互作用底物 U5小核核糖核蛋白的解旋酶 胎儿血红蛋白亚单位
(Kinase D-interacting substrate of 220kDa) (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase) (Hemoglobin fetal subunit beta)

10

膜联蛋白A2 β4微管蛋白 β5微管蛋白
(Annexin A2) (Tubulin beta-4B chain) (Tubulin beta-5 chain)
                                                                                                                                                                                               


10.5.png

成对组合相关性比较


10.png

 


应用数据


11.png


Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度


  Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸(BCA)定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒,是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为,碱性条件下的蛋白质Cu2+离子被还原为Cu+。Cu+与BCA形成络合物,即产生紫色螯合物,蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关,通过测定562nm处的吸光度,并与标准曲线做比照,即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体,通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。


【实验内容及结果】

  将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25μL外泌体溶液分注于96孔板中,加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟,检测560nm吸光度(图1)。结果表明,通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测,可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

12.png

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低,因此BCA测定时不要稀释样品。

①    将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL和空白对照,分别每孔25μL加到96孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液(空白)按照每孔25μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit(产品编号:297-73101)的试剂A盒试剂B混合液(A:B=50:1)加入放有样品的孔板中。

④    60℃孵育30分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定560nm的吸光度


产品编号

产品名称

包装

零售价

优惠价

297-73101

Protein Assay BCA Kit

250次用

1680

1512

蛋白测定试剂盒(二喹啉甲酸)

015-25613

2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum

1mL×10

咨询

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2mg/mL 牛血清蛋白溶液



◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验


【实验概要】

用PKH67(Sigma公司)标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡, Hela细胞导入确认


<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体(实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体)

2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度

3. 将相当于5μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5mL管中。

*请配制合适的使用量

4. 将2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*请配制合适的使用量

5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中,混合后在室温中孵育5-10分钟。

6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns (MW 3000) (Thermo公司)。

7. 将100μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中,离心(最大添加量:100μL)。

*准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中,24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

*根据实验调节外泌体添加量


13.png

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察


从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品,通过PS亲和法提取外泌体。

●      提取的外泌体蛋白质浓度:22.3ng/μL

●      粒子浓度:1.2×108 particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中,24小时后用荧光显微镜(左)和流式细胞仪(右)检测捕获情况。

Opti-MEM:取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。


14.png

 


◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作


  样品预处理:对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体,则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。

  下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作,请参考血清/血浆的实验步骤,做适当调整。


1815240233299959.png


更换缓冲液(限制过滤)操作

用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20(100K)中。

2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20(100K)中,

 混匀。

3. 把第2. 的VivaSpin20(100K)在4℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 缓冲液。

5. 4℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 缓冲液。

7. 4℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后,在VivaSpin20(100K)中追加11 mL TBS 缓冲液。

9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。

10. 进行提取。

 


◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤


16.png



货号

名称

规格

零售价

*优惠价*

299-77603

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 

2 tests

2240

¥2,016

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

(10次回收)

293-77601

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 

10 tests

8980

¥8,082

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

(50次回收)


◆相关产品

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产品名称

产品规格

零售价

优惠价

297-79201

PS Capture™外泌体ELISA试剂盒 

96次

6510

5859

(抗小鼠IgG POD)

290-35591

Magnet Stand

1个

6720

6057

  MagCapture系列磁珠捕获用磁力架 

299-77603

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

2次用

2240 

2016

 MagCapture外泌体提取试剂盒PS

293-77601

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

10次用

8980

8082

 MagCapture外泌体提取试剂盒PS

016-27061

Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 

20ul

1010

1109

 抗CD63单抗(3-13) 

012-27063

Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13) 

100ul

3370

3233

抗CD63单抗(3-13)

CAC-SHI-EXO-M02-50UL

Anti CD63 for Exosome Isolation

50ul

咨询

咨询

CD63 外泌体提取抗体 

CAC-SHI-EXO-M01-100UL

Anti CD9 for Exosome Isolation

100ul

咨询

咨询

外泌体分离抗体CD9 

CAC-SHI-EXO-M02-100UL

Anti CD63 for Exosome Isolation

100ul

咨询

咨询

外泌体分离抗体CD63 

CAC-SHI-EXO-M03-100UL

Anti CD81 for Exosome Isolation

100ul

咨询

咨询

外泌体分离抗体CD81 

CSR-SHI-EXO-K010

ExoTrap  Exosome Isolation Spin Column Kit,

1 kit

咨询

咨询

 for Protein Research 

外泌体分离亲和柱套装,蛋白研究用 

295-71701 

microRNA Extractor ®SP Kit 

50次用

6400

5760

microRNA 提取试剂盒


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新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用


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★MagCaptureTM 外泌体分离试剂盒  常见问题

★外泌体提取操作记录

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