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细胞增殖检测实验的意义

细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析，分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。

肿瘤细胞增殖和转化过程

细胞增殖检测实验的分类

细胞增殖检测实验根据实验方案和目的不同分为以下几种：

1. 细胞代谢活性检测   通过检测活细胞相关的物质的含量（如蛋白质、酶）等间接地测定待活细胞的数量来评价细胞的增殖能力。

• 特点：间接的方法，反应的是细胞活性而非是否在增殖；

• 常见实验举例：MTT、XTT、MTS、CCK8法及SRB法；

• 应用：细胞活力、药物作用的毒性，适合高通量分析实验。

2. 细胞DNA合成检测   通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力。

• 特点：直接测定DNA合成是检测细胞增殖最准确方法；

• 常见实验举例：BrdU和EdU；

• 应用：细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等。

3. ATP浓度检测   利用荧光素酶Luciferase反应细胞ATP的含量，进而反应细胞活性。

• 特点：结果灵敏；

• 常见实验举例：荧光素酶催化反应；

• 应用：高通量细胞增殖检测和筛选。

4. 细胞增殖相关抗原检测   通过检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA等常作为人体细胞增殖的标志。

• 特点：反应体内肿瘤细胞的增殖能力，但是需组织切片不适合高通量；

• 常见实验举例：细胞增殖的标志物的免疫组化等；

• 应用：体内肿瘤组织。

5. 染料排斥法   活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。适合少量细胞的统计，广泛用于绘制细胞生长曲线等。

其中，基于细胞代谢活性的检测包括：酶活性如MTT、MTS、CCK8等；蛋白含量的SRB实验。又可统称为比色法，主要基于颜色的变化来反应细胞数量，十分适合高通量药物筛选，进而计算药物的IC50。

一、细胞代谢活性检测

A.   MTT、MTS、CCK8等

这一类的实验原理基本类似，细胞线粒体的脱氢酶可将MTT、MTS、CCK8等试剂还原为有色产物，可在酶标仪上于不同波长（490nm、490nm、450nm）处检测OD值，在一定范围内，吸光度值与活细胞数目成正比，进而反应细胞数量。

MTT是最早出现的检测方式，于1983年由Mosmann建立的方法，MTT为四唑盐，但是存在一定的缺陷，特别是还原产物不溶水，且对细胞有较大毒性，因此限制了其使用，目前基于MTT开发的MTS、CCK8等，应用更加广泛。

MTT对细胞的毒性：

A图为刚加入MTT（0.5mg/ml）NIH-3T3细胞形态，B图为加入MTT后4h，细胞形态发生了明显改变[1]。

如下为MTS的原理：MTS被乳酸脱氢酶还原为黄色的Formazan

1. MTS的操作步骤：

1. 细胞接种到96孔板培养；
   

2. 37℃培养箱培养几天；

3. 培养完成后，每孔加入MTS和PMS（20:1比例）混合溶液后继续孵育2-3h，现在大部分公司提供的商品化MTS已处理好可以直接加入进行检测；

4. 终止培养，使用酶标仪，在490nm处测定吸光度值；

注意：避光操作。为了保证实验结果有良好的线性，MTS实验中吸光度值应保持在0.75-1.25之间较好；肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。

优点：

1. 操作简单，比MTT高效，产生水溶性的Formazan，无需用DMSO溶解；

2. 由于MTS被还原产物颜色较深，吸光度值变异范围大，使测定更加敏感准确；

3. 快速，作用时间2-3小时为最佳，而MTT需4小时；

4. 重复性好，还原产物稳定。

2. CCK8法的操作步骤：

1. 细胞接种到96孔板培养；
   

2. 培养完成后，每个孔中加入10μLCCK8试剂；

3. 37℃培养箱中孵育1-4h；

4. 使用酶标仪，在450nm处测定其吸光度值。

优点：

1. 使用方便，检测快速；

2. 灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；

3. 对细胞毒性小；

4. 产物水溶性，不需换液，尤其适用于悬浮细胞。

缺点：与MTT相比，CCK-8和MTS的价格贵。

注意：避光操作。

B.   SRB比色法

SRB磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B)，一种粉红色阴离子染料，在酸性条件下可特异性地与细胞内碱性氨基酸结合；在540 nm波长下产生吸收峰，在一定范围内，吸光度值与活细胞数目成正比。

实验步骤：

1. 从培养箱中取出培养好的待检测细胞量的96孔板样品；

2. 每孔加入TCA（50%的三氯乙酸）固定细胞，4℃放置1h；

3. 弃去固定液，蒸馏水洗5-6次，室温晾干或吹风机吹干；

4. 每孔中加入SRB染液100μL，室温放置10-30min；

5. 弃去染液，用1%醋酸洗涤，直至在白色纸上倒扣轻拍无明显染料颜色；

6. 每孔加入150μLTris溶液；

7. 用酶标仪在515nm处测定吸光度值；

注意：SRB实验结果中OD值在0.8-1.2之间时线性较好；肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。

优点：不存在孵育时间限制，即细胞固定后可以放置较长时间；与MTS,CCK8相比，检测时间可以自己掌握，不受限制，更适合大规模试验。

缺点：操作步骤繁琐，不适合悬浮细胞。

如下图，图A表示肺癌细胞系H441细胞数量与SRB染料对应的吸光度值成线性关系，B图显示SRB方法来测试miRNA对两株肺癌细胞细胞系的增殖影响[2]。

比色法因为操作简单快捷，成本相对便宜等优点十分适用于高通量的药物筛选。然而，对于少量细胞或者单个细胞细胞增殖活性分析，比色法却是不合适的，此时又该选择什么样的方法呢？且往后看……

对于少量细胞或单个细胞增殖的检测一般从以下方面着手：

_{二、DNA合成检测}

通过测定分裂的细胞DNA含量，直接反应细胞的增殖能力，以最常见的BrdU和EdU为例[1]。它们的基本原理相似，作为胸腺嘧啶的衍生物，可以参与到DNA复制中，代替正常的胸腺嘧啶（T），进而通过抗体或者荧光标记等方式检测，进而反应DNA的含量。下面具体看一下这两种方法上的不同及其特点。

1. BrdU插入

方法：基于BrdU特异性抗体检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力

实验步骤：孵育细胞→加入BrdU工作液→甲醇/醋酸固定细胞及DNA变性→孵育加1抗即抗BrdU单抗（工作浓度1：50）→加HRP标记的二抗→显色。

实验步骤来源于abcam：BrdU CellProliferation ELISA Kit(colorimetric)）




数据分析：如下图：通过ELISA方式检测BrdU标记的细胞，发现ELISA OD值在一定范围内有良好的线性关系；未加入BrdU不能检测到信号；H₂O₂处理细胞后抑制增殖。



BrdU通过ELISA方式检测




缺点：


• 由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测，需要进行DNA变性；

• BrdU检测需要孵育BrdU单抗和带标记的二抗，时间长甚至过夜；

• BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。

2. EdU插入




方法：通过EdU与Apollo荧光染料的共轭反应，使得染料标记到EdU插入的增殖中的细胞，进而快速检测细胞DNA复制活性。




实验步骤：孵育细胞→加入EdU→固定细胞→加染料→荧光检测





数据分析：下图利用荧光显微镜，对EdU标记的各个细胞（图1）或不同的组织（图2）均能识别，起到标记增殖中细胞DNA的作用。其中蓝色代表细胞核（DPAI）。





上图源于：Cell-Light™ EdU荧光显微镜检测试剂盒说明书

优点：与BrdU检测方法相比，EdU：

• 更快速：只需2.5h，无需抗原抗体反应；

• 更灵敏：EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散；

• 更准确：无需DNA变性，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

三、细胞增殖相关抗原检测




检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此常作为细胞增殖的标志。




实验过程：即免疫组化过程，基于一抗二抗孵育原理，由于比较繁琐，我们后期会单独介绍。




数据分析：如下图对癌组织进行的Ki67和PCNA染色，褐色代表Ki67和PCNA的表达，可见药物处理后，Ki67和PCNA表达降低，即细胞增殖能力降低。



免疫组化检测肿瘤组织Ki67的表达[2]



免疫组化检测肿瘤组织PCNA的表达




四、ATP浓度检测




原理：ATP是细胞能量的直接来源，死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。

方法：目前应用最广的方法：基于萤火虫荧光素酶催化荧光素氧化，消耗ATP。发光量与ATP含量呈很好的线性关系，反应如图显示：






实验步骤：

1. 样品测定的准备：按照说明书加入专用裂解液，冰上裂解后离心去上清；

2. 标准曲线测定的准备：ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成适当的浓度梯度；

3. ATP检测工作液的配制：按照每个样品或标准品需100μL的ATP检测工作液的比例；

4. ATP浓度的测定：

1. 加100μL的ATP检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底；

2. 在检测孔或检测管内加上10-100μL样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2s后，立即用 luminometer仪测定RLU值或CPM。如果样品中ATP的浓度特别高，可以用MilliQ级的纯水或重蒸水稀释样品后再测定；

3. 根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度；

4. 为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度，然后把ATP的浓度换算成nmol/mg蛋白的形式。

5. 根据ATP与处理组方案如药物浓度绘制曲线。




数据分析：如图：HepG2细胞经不同浓度Tamoxifen处理后，经过ATP检测试剂盒得到的荧光值与药物拟合的曲线；要注意的是ATP检测时，试剂孵育时间不能过长，否则会影响实验准确性。



药物处理后的HepG2细胞的ATP曲线[3]




那么在这些方法中，我们究竟应该如何选择呢？这主要取决于实验目的和细胞类型以及数目。




• 若直接测细胞增殖：可用BrdU或EdU标记法，其中EdU更加快捷准确。

• 如研究细胞的代谢活性：那么直接选择比色法检测，即MTS、CCK8及SRB法等；

• 若是高通量的药物筛选：悬浮细胞推荐采用MTS，CCK-8这两种方法，操作较为简单；若是贴壁细胞推荐SRB法，不受时间限制，且有很好的线性关系。

• 但若药物带有颜色：药物的高通量筛选，且药物处理时间较短，带有颜色，推荐采用基于ATP的检测方法。

• 细胞类型：如果是悬浮细胞，不适合SRB和MTT，推荐使用MTS和CCK8法。

• 研究单个细胞：适合选择BrdU或EdU标记法，不适合比色法。

• 研究少量细胞：如果细胞数少于500，则推荐使用基于ATP的检测方法；

• 若对细胞增殖及代谢等多个方面感兴趣：可以通过多种方法来验证，如可以选择用BrdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。




常见问题汇总




MTS、CCK8及SRB法等方法，如何确定选择哪个？

大家可根据实验要求和预算进行选择，价格方面，CCK8和MTS大于SRB，但是SRB操作较繁琐，但个人觉得SRB线性更好，但不适用于悬浮细胞。




OD不在线性范围内，怎么办？误差大吗？

如MTS要求0.8，（通常来说，比色法测定细胞增殖试剂盒中都会注明最佳反应时间，通常MTS/CCK8反应最佳时间为1h-4h，我们实验初期固定孵育时间如1h，通过比较不同细胞量的OD值来确定实验细胞铺板量，根据具体情况进行调整。




对细胞密度有要求吗？

不同类型的细胞，代谢活性不同，影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。细胞在高细胞密度时会产生接触抑制，进而代谢活性降低，导致细胞数和吸光度值的非线性关系。对大多数肿瘤细胞，杂瘤细胞和纤维母细胞系，推荐5000cells/孔作为增殖研究的起始细胞数，虽然少于1000个细胞通常也可被检测。血淋巴细胞例外，一般需要25,000–250,000细胞/孔才能获得足够的吸光值。可以参考下图的实验来确定细胞数。



通过以上介绍，相信大家对细胞增殖的检测方法有了比较系统的认识，在具体实验中，只需要根据具体的实验目的和细胞类型选择最佳的实验方案。


祝大家实验顺利~