细胞培养知识库：细胞系和培养环境（五）

选择合适的细胞系

为自己的实验选择合适的细胞系时，请注意以下标准：

• 种属：非人类和非灵长类动物细胞系的生物安全限制通常较少，但是否需要使用种属特异性的细胞培养物，则由所要开展的实验来最终决定。

• 功能特征：实验的目的是什么？例如，肝脏和肾脏来源的细胞系可能更适合用于毒性检测。

• 有限细胞系或连续细胞系：虽然选择有限细胞系会使您在表达正常功能方面具有更多的选择，但是连续细胞系往往更容易扩增和维持。

• 正常或转化的细胞系：转化细胞系通常生长速度快，接种效率较高，并且可以连续培养，培养基中需要的血清也较少，但是由于遗传转化，其表型已经发生了永生性变化。

• 生长条件和特性：您对细胞的生长率、饱和密度、克隆形成率以及悬浮生长能力有何要求？例如，要大量表达重组蛋白以获得高产量，您可能应选择生长迅速且能够悬浮生长的细胞系。

• 其他标准：如果您使用的是有限细胞系，您的细胞储备充足吗？细胞系的特性是否明确？需要自己进行验证吗？如果您使用的是异常细胞系，您是否有等效的正常细胞系可用作对照？细胞系稳定吗？如果不稳定，那么这种细胞容易扩增以便为实验提供充足的冻存储备吗？

获取细胞系

细胞培养的一大优势在于能够控制细胞繁殖的物理化学环境（即温度、pH值、渗透压、O₂和CO₂ 张力）和生理环境（即激素和营养浓度）。除温度外，培养环境由生长培养基控制。虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过更好地了解血清成分、确定增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境（即细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用），现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。

贴壁培养与悬浮培养

目前，主要有两种基本的细胞培养体系，一种是使细胞在人工基质上单层生长（贴壁培养），另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长（悬浮培养）。除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在合适的基质上培养，且该基质必须经过特殊处理，以便细胞附着和铺展（即经组织培养处理） 。但是，许多细胞系也可采用悬浮培养。同样，大多数市售昆虫细胞系在单层或悬浮培养物中生长良好。悬浮培养细胞可在未经组织培养处理的培养瓶中培养，但随着培养物体积与表面积之比（通常为0.2-0.5 mL/cm² ）的增加，阻碍了气体的充分交换，因此需要对培养基进行搅拌。这种搅拌一般通过磁力搅拌器或者旋转瓶实现。

细胞的后续实验往往决定了细胞培养的形式和培养基。除了经过标准组织培养处理和未经处理的表面外，还使用了其他表面改良技术来获得预期的细胞培养结果。例如，低细胞结合的表面处理可直接防止贴壁依赖性细胞附着在培养容器的表面，从而在生成细胞球状体的悬浮培养物方面，比未经处理的表面更具优势。将这种系统与旋转瓶相结合，可以大规模生产球状体。

培养基

培养基是培养环境中最重要的组成部分，因为它为细胞生长提供了必要的营养、生长因子和激素，并调节培养物的pH值和渗透压。

尽管最初的细胞培养实验使用从组织提取物和体液中获得的天然培养基进行，但对标准化和培养基质量的需求不断增长，促进了化学成分确定的培养基的发展。培养基的三个基本类别分别是基础培养基、减血清培养基和无血清培养基，三种培养基对血清添加的要求有所不同。

基础培养基

大多数细胞系在含有氨基酸、维生素、无机盐和碳源（例如葡萄糖）的基础培养基中生长良好，但在这些基础培养基的配方中必须进一步添加血清。

减血清培养基

在细胞培养实验中，减少血清不良影响的另一种策略是使用减血清培养基。减血清培养基是富含营养物质和动物源性因子的基础培养基配方，可减少所需的血清量。

无血清培养基

无血清培养基（SFM）通过用适当的营养和激素配方替代血清，避免了使用动物血清的问题。无血清培养基配方适用于许多原代培养物和细胞系，包括用于生产重组蛋白的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系、各种杂交瘤细胞系、昆虫细胞系Sf9和Sf21（草地贪夜蛾）以及用作病毒生产宿主的细胞系（例如293 、VERO、MDCK、MDBK等）。使用无血清培养基的主要优势之一是，能够通过选择生长因子的适当组合使培养基对特定细胞类型具有选择性。下表列出了无血清培养基的优点与缺点。

优点：

• 成分限定程度增加

• 性能更加稳定

• 更易于纯化和下游处理

• 生产率提高

• 细胞功能的精确评价

• 更好地控制生理反应

• 细胞介质的增强检测

缺点：

• 对特定细胞类型培养基配方有所要求

• 试剂纯度要求更高

• 生长放缓

细胞培养基最佳实践方案

下面是一些简单的提示和技巧，可以帮助您确保细胞培养基保持最佳性能。

CellMax提供各种经典的培养试剂，如胎牛血清、基础培养基、无血清培养基，以及抗生素和消化试剂等，供您进行细胞培养实验。

培养基

血清

作为生长和附着因子、激素、脂质和矿物质的来源，血清对于在基础培养基中进行的细胞培养至关重要。此外，血清还调节细胞膜的通透性，且是脂质、酶、微量营 养素和微量元素进入细胞的载体。尽管可以获得并利用其他动物血清（例如马、 兔、山羊、猪等），但胎牛血清（FBS）仍然是使用最广泛的血清。

与小牛和成年牛血清相比，FBS含有少量的丙种球蛋白、较高水平的生长因子和较少的补体蛋白。这使得FBS非常适合于促进增殖细胞生长，同时也降低了哺乳动物细胞在培养物中结合或裂解的可能性，从而成为FBS优先于其他动物血清的合理理由。然而，在培养基中使用血清存在一些缺点，包括成本高，标准化、特异性和差异性方面的问题，以及对某些细胞培养物的不良影响，例如刺激或抑制生长和细胞功能。如果血清的来源不可靠，污染也会对成功的细胞培养实验构成严重威胁。

细胞培养塑料耗材

细胞培养塑料表面

多年来，许多不同类型的塑料已用于细胞培养和基于细胞的检测。包括聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、高密度和低密度聚乙烯（PE）、聚氯乙烯（PVC）和聚丙烯 （PP），但目前实验室中最常用的塑料是聚苯乙烯（PS）。PS的低成本及其惰性化学性质使其成为一次性培养表面的最佳选择。在其纯粹形式下，PS是疏水性的，这非常适合悬浮细胞培养。但是，除造血细胞系和其他一些细胞外，大多数脊椎动物细胞均具有贴壁依赖性，必须在表面上培养， 且该基质必须经过特殊处理，以便细胞附着和铺展，此类表面称为组织培养（TC） 处理的表面或经细胞培养处理的表面。该处理过程包括将PS表面暴露于等离子体气体中，等离子体气体会部分修饰和切割聚合物链，留下含氧官能团，如羟基和羧基。PS表面产生的负电荷使其更具亲水性，并改善了贴壁依赖性细胞的附着情况。通过对表面进行包被，可以进一步优化PS表面的特性，例如使用多肽（如多聚-D- 赖氨酸或PDL）、蛋白质（如胶原）或多糖。PDL是一种化学合成的聚阳离子细胞 外基质（ECM），可帮助介导细胞膜和表面的负电荷，从而促进细胞附着到经TC处理的塑料上。

ECM蛋白质（如胶原蛋白）为某些类型的细胞（在经TC处理的常规表面上生长有困难）的附着和生长提供了附着框架。I型胶原适用于内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞和肝细胞。IV型胶原是基底膜的主要组成成分，为细胞提供更具生理相关性的生长条件。

细胞培养容器

培养皿：细胞培养皿是一次性的浅容器，专门设计用于支持培养细胞的生长和繁殖。有多种尺寸（单孔或多孔）可供选择，通常由PS或聚碳酸酯制成，从而可实现无失真显微镜观察。通常配有盖子，以提供持续的气体交换，同时提供环境保护。与培养瓶相比，使用培养皿时，从转染的细胞群中选择单个菌落要更为容易。

培养瓶：根据应用的不同，可采用未经处理、经TC处理或用其他材料处理的细胞培养瓶。培养瓶大小为12.5 cm²到300 cm² 不等，可以是直颈，也可以是弯颈。弯颈具有多个优点，包括使操作人员更容易接触到整个生长表面，有助于防止培养基接触到盖子，并允许从培养瓶中倒出培养基且减少滴落。

滚瓶：滚瓶是为疫苗工业规模生产、单克隆抗体和生物治疗等应用而开发的，由PS 或聚对苯二甲酸乙二酯（PETG）制成。与培养瓶相比，滚瓶具有更大的生长表面， 能够使培养基在细胞上缓慢而稳定地混合，并有助于增加培养基与表面的接触。

孔板：细胞培养板的孔数从4个到384个不等，可一次用于多种培养。根据应用的不同，细胞培养板有未经处理、经TC处理或用其他材料处理的培养板。对于TC板，仅处理孔的底部，保持壁的疏水性。经TC处理的孔板可为细胞附着和生长提供一致 且相容的表面。

培养腔室玻片：培养腔室玻片由一个可拆卸的培养基腔室组成，该腔室与一个经过处理用于贴壁细胞培养的玻片相连。它使您可以在单个显微镜载玻片上进行接种、培养、固定和染色。一些培养腔室玻片具有模拟PDL涂层特性的经化学修饰的生长表面。

试管：有多种用于培养、离心或储存细胞的试管。经TC处理的试管可用于培养，而锥形离心管可用于从样本储存到细胞分离等各种应用。

PH值

大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH值为7.4的环境中生长良好，而且不同细胞 株间差异极小。但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境（pH 7.0-7.4）中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合在轻度偏碱性的环境（pH7.4-7.7）中生长。Sf9和Sf21等昆虫细胞系在pH值为6.2的环境中生长情况最佳。

CO₂

生长培养基可控制培养物的pH值，为培养细胞pH值的变化提供缓冲作用。通常，这种缓冲作用通过添加有机（例如HEPES）缓冲液或者CO₂ -HCO₃-（碳酸氢盐）缓冲液实现。培养基的pH值取决于溶解态CO₂与HCO₃-间的精密平衡，因此，空气中CO₂含量的变化会改变培养基的pH值。为此，使用含CO₂ -HCO₃-缓冲液的培养基时必须使用外源性CO₂ ，特别是使用开放式培养皿培养细胞或者需要在高浓度条件下进行细胞系培养时。虽然大多数研究人员通常使用的是空气中CO₂浓度为5-7%培养基，但是4-10%浓度的CO₂适用于大多数细胞培养实验。然而，每种培养 基均具有其推荐的CO₂张力和碳酸氢盐浓度，以便达到适当的pH值和渗透压；更多信息，请参阅培养基生产商提供的说明书。

温度

细胞培养的最佳温度主要取决于分离来源的细胞宿主的体温，此外也部分受到解剖部位体温差异的影响（例如皮肤温度可能低于骨骼肌的温度）。与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题；因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度的温度。

• 大多数人类和哺乳动物细胞系在36°C至37°C下具有最佳生长状态。

• 在27°C下培养是昆虫细胞的最佳生长条件；它们在较低温度和27-30°C之间的温度下生长较慢。高于30°C时，昆虫细胞的存活率降低，即使温度恢复到27°C，细胞也无法恢复。

• 禽类细胞系需要38.5°C才能实现最大程度的生长。尽管这些细胞在37°C时也可以进行培养，但它们的生长速度更慢。

• 源自冷血动物（例如两栖动物、冷水性鱼类）的细胞系可在15°C至26°C这一较 宽的温度范围内生长。

请注意，每种细胞类型的细胞培养条件各不相同。偏离特定细胞类型所需培养条件，可能导致异常表型的表达乃至细胞培养彻底失败等后果。因此，我们建议您熟悉您感兴趣的细胞系，并严格遵循实验所用每种产品的随附说明进行操作。