动物细胞培养指南（三）

细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。

制备完全培养基都需要哪些物质？有什么注意事项？

基础培养基

细胞培养基成分复杂，包括盐类、糖类、维生素、氨基酸、代谢前体、生长因子、激素和微量元素。对这些物质的需求因细胞而有差异，这也导致大量的不同培养基配方出现。主要碳源物质通常是葡萄糖，有时也会使用半乳糖代替，这是因为半乳糖的代谢速度较慢。氨基酸（尤其是L-谷氨酰胺）和丙酮酸盐也可作为碳源。

除了营养成分，培养基也会帮助维持培养体系的pH和渗透压。pH的维持依靠一种或多种缓冲液体系，最常见的包括CO₂/NaHCO₃、磷酸盐和HEPES等，血清也可以作为完全培养基的缓冲液。酚红作为pH指示剂加入培养基中，可通过颜色变化监测pH变化。

1.碳酸氢钠和缓冲液

细胞的存活和生长，需要CO2同时也会产生少量CO₂。在培养基中加入CO₂可以与HCO₃-形成平衡，所以很多种类的培养基会通过CO₂/HCO₃-体系平衡pH。CO₂直接溶解在培养基中并形成H₂CO₃。随着细胞代谢并产生更多的CO₂，培养基pH下降并导致下面的化学平衡向右移动：

H₂O + CO₂←→ H₂CO₃ ←→H+ + HCO₃-

理想的pH范围是7.2—7.4，可以通过补充NaHCO₃和调节上层空气中的CO₂水平来维持，化学过程如下：

H₂O+CO2+NaHCO₃←→H+ + Na+ + 2HCO₃-

组织培养时，细胞可能在开放体系中（培养基上层空气和培养箱中空气可以自由交换）生长，也可能在封闭体系中（培养基上层空气和培养箱中空气相互隔离）生长。培养基中的缓冲体系需要与这些培养方式匹配，否则细胞状态会由于代谢压力而变差。

封闭体系中的CO₂水平是由细胞代谢调节的。培养容器必须密封（如拧紧细胞瓶盖）以保存细胞产生的CO₂。因此，与开放体系相比，封闭体系可以对细胞提供更多的保护以避免污染，对培养箱的要求也更低。封闭体系使用的缓冲体系通常基于Hank's液，该体系的NaHCO₃水平较低。

在开放体系中培养细胞时，可通过控制空气湿度（可以减少培养基蒸发）和CO₂的调节方式（如果培养基含NaHCO₃）来维持pH。在开放体系中，需要含更高NaHCO₃浓度的Earle's平衡盐溶液，并且由培养箱维持5-10%CO₂。通常，1.2-2.2g/L NaHCO₃配合5% CO₂，3.7 g/L NaHCO₃配合10% CO₂。精确的计量因培养基配方而不同。

有些情况下，研究人员会向培养容器中连续充入过滤除菌并含5% CO₂的空气，然后严格密封并放置在干燥且无CO₂的培养箱中。实际上，这时培养基也是处于开放系统中。

2.HEPES

HEPES和其他有机缓冲液可以有效调节培养基pH，适用于多种细胞系。实际上，某些标准培养基配方包含HEPES。但是，HEPES可能会有毒性，尤其是对某些已分化细胞，所以使用前需首先评估其效果。

3.酚红

酚红可作为培养基的pH指示剂。酚红在低pH时显示黄色，在高pH时则显示紫色。绝大多数组织培养时，pH为7.4，应显示为鲜红色。

4.L-谷氨酸钠

L-谷氨酰胺是所有哺乳动物细胞和昆虫细胞的必需氨基酸。与其它氨基酸相比，L-谷氨酰胺在液体培养基中更不稳定。因此，为了延长保质期，商品化的液体培养基中经常不添加L-谷氨酰胺。这种情况下，使用前要先无菌加入L-谷氨酰胺。由于在干燥状态下比较稳定，所以绝大多数干粉培养基中都已预添加L-谷氨酰胺。

5.非必须氨基酸

所有培养基配方包含十种必需氨基酸，同时包括半胱氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸。在一些培养基配方中包含其他非必需氨基酸(丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，甘氨酸，谷氨酸，脯氨酸，丝氨酸)，降低了细胞的代谢负担，有利于细胞增殖。

培养基添加物

细胞培养使用的完全培养基，需要添加一些在基础培养基和血清中没有的成分，包括激素，生长因子及信号分子，目的是维持细胞增殖和正常的细胞代谢功能。

添加物可以改变完全培养基的渗透压，这可能影响细胞的生长。加入添加物后，最好重新检查一下完全培养基的渗透压。对于脊椎动物细胞系适宜的渗透压在260 mOSM/kg 到 320 mOSM/kg。

添加剂加入基础培养基后，完全培养基的质保期需要根据具体情况决定。如果完全培养基包含蛋白类添加剂（如：表皮生长因子、牛血清白蛋白等），降解速度会比基础培养基更快。

渗透压

虽然大多数细胞系可以承受的渗透压压力范围比较宽泛，但脊椎动物细胞承受的压力范围较窄，在260 mOsm/kg 至 320 mOsm/kg。相比之下，无脊椎动物细胞承受的渗透压不在这个范围内。例如, 蜗牛胚胎细胞，需要渗透压大约155 mOsm/kg，然而有些昆虫细胞在360mOsm/kg至375 mOsm/kg更适宜生长。大多数商业培养基会标注渗透压，在盐溶液，药物或者激素溶解在酸性或碱性溶液，或者加入较大体积缓冲溶液（如：HEPES）后，需要检测培养基渗透压。

抗生素

抗生素或抗真菌剂加入到细胞培养基中一般用于以下目的：

1）预防污染；

2）一旦发现污染作为一种挽救手段；

3）诱导表达重组蛋白；

4）保持转染细胞的选择性压力。

在常规细胞培养中，除非特别需要，一般不推荐使用抗生素或抗真菌剂。因为抗生素对许多细胞有毒性，并且掩盖支原体、细菌污染。此外，它们可以干扰敏感细胞的代谢。

如果使用抗生素，青霉素链霉素溶液可以每100ml的细胞培养液加入0.5-1 ml，使青霉素终浓度为50-100 IU/ml，链霉素终浓度为50-100μg/ml。另一种抗生素庆大霉素，使用终浓度为50-100μg/ml。抗真菌两性霉素B使用终浓度2.5 μg/ml。以上浓度适用于含血清培养基。对于无血清培养基，至少减少50%的浓度。

动物血清

血清在细胞培养中为细胞提供氨基酸，蛋白质，维生素（特别是脂溶性维生素如A，D，E，K），碳水化合物，脂肪，激素，生长因子，矿物质及微量元素。此外，血清还可以缓冲培养基，抑制蛋白水解酶，增加培养基的粘度，降低在移液或搅拌时造成的剪切力。

1.储存：

血清的保质期是5年，储存温度小于-10℃。

血清长时间储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，长期保存血清必须在-10℃以下储存，并避免反复冻融。

2.解冻：

将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

如果在37℃或更高的温度解冻血清，血清中会出现沉淀。此沉淀可能包括磷酸钙结晶，但不改变血清的性能。血清热灭活也会导致沉淀的形成。

3.浑浊和沉淀：

所有的血清可能保留一些纤维蛋白原。某些外部因素可能引发纤维蛋白原转变为纤维蛋白，导致血清解冻后可能会观察到絮状物或混浊。这些物质的存在不会改变血清的性能。如果有必要，可以通过400g离心1min离心去除。

4.热灭活：

通常不使用热灭活血清，除非某些特定的细胞系特别需要。热灭活通常是不必要的。热灭活会降低或破坏血清中的生长因子，影响某些细胞的生长。

热灭活最初是为了灭活补体及支原体。目前，如果血清中出现支原体，可以通过过滤去除。而去除补体通常是不必要的，除非是在准备或检测病毒或细胞毒性试验时。有研究显示，血清37℃孵育就可以灭活血清中热不稳定的补体成分。只有很少一部分细胞在这种灭活血清中生长得更好。如胚胎干细胞和许多昆虫细胞。

下面的程序可用于热灭活血清：

1）按正确操作解冻血清，恢复室温。

2）水浴56℃提前预热。

3）将准备好的血清和装有相同体积水的烧杯同时放入水浴锅，当烧杯中的温度计指示达到56℃时开始计时，灭活30min后结束，整个过程中需要随时摇晃混匀。