FAQ(常见问题分析)

Q1.    Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒推荐脂质体转染还是电转染？

Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒主要组分是DNA，同时适用于脂质体转染和电转染。可以根据不同的细胞类型选择合适的转染参数，一般贴壁细胞同时适用于两种转染方式，悬浮细胞建议采用电转染。

Q2.    不同细胞系如何优化转染参数？

Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒包含eGFP对照质粒，您可以根据试剂盒操作说明进行转染测试，如果转染后48h荧光率大于50%，说明转染效果良好。如果荧光率不理想，可以按照转染试剂的推荐优化方案，使用eGFP对照质粒进行转染参数摸索。对于一些较难用脂质体转染的细胞，如悬浮细胞，我们推荐电转染。

Q3.    通过Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒获得的是杂合子还是纯合子，如何获得所有等位基因敲除的纯合子？

通过Puro药筛、细胞单克隆化，可以获得的是靶基因定点插入Donor的单克隆细胞。可以通过PCR鉴定进一步确认是纯合子或者杂合子，我们建议您测序鉴定小条带。如果小条带与野生型基因组序列一致，这个克隆是杂合子；如果小条带存在indels (插入和删除)，这个克隆是纯合子。

Q4.    Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒的原理是什么？为什么Donor可以整合到基因组？

Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒是基于CRISPR-Cas9基因编辑技术实现的。Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的20 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点，产生双链断裂（DSBs）。细胞通过非同源末端连接途径（NHEJ）修复通常会产生小的片段或碱基缺失，插入和碱基置换等突变，Donor DNA 通过NHEJ修复插入到SDB位点。大多数敲除细胞可以实现双等位基因敲除，一个等位基因包含Donor DNA整合，另一个等位基因包含indels (插入和删除)，可以阻遏蛋白质编码或者导致翻译提前终止。

Q5.    Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒的优势是什么？

Cas9x3.0基因敲除试剂盒包含2个gRNA载体和Donor DNA。Donor DNA中的选择荧光和抗性标记大大提高了筛选效率，并且对分裂细胞和非分裂细胞都更有效，可以实现大多数敲除细胞双等位基因敲除，敲除效率远高于传统的单gRNA基因敲除试剂盒。

Q6.     Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒的实验周期是多久？

按照正常的实验周期，仅需一个月就可以获得敲除的多克隆细胞株，但是由于不同的细胞的增殖速度和克隆形成速度的差异和传代的差异，时间应该在2个月左右能够拿到纯合单克隆。

Q7.    Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒的实验如何进行单克隆？

按照正常的推荐，我们建议使用极限稀释或者是固定稀释的方式，进行单克隆的扩增。但是是否能够成功获得单克隆，需要在实验中按照每种细胞和每个细胞株的情况进行优化实验条件。

Q8.    Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒是否可以获得敲低的细胞株？

按照推荐的实验进行，可以获得单克隆，但是如果仅需要敲低的细胞株，可以在传代后进行药筛之后富集的细胞株进行扩增即可获得敲低的效果，但是由于不同基因的影响不同，所以敲低的效果在不同的细胞株中有差异。

Q9.    Cas9x3.0 CRISPR基因敲除试剂盒是否判断有敲除的活性？

不同的细胞株在敲除上面会有差异，所以不同的细胞株的敲除效果会有差异，主要是由于转染方式和转染试剂的转染效果差异引起的，所以使用eGFP表达载体进行验证非常重要，能够保证目的细胞的GFP表达效率高于50%是试剂盒高效工作的基础。如果测试的时候不能确定细胞株是否符合Lipo和电转仪的测试结果，建议先使用对照质粒进行验证后再进行基因敲除的实验。

所有GFP超过50%的细胞株都能够保证可以PCR筛选到敲除条带，并通过细胞克隆操作就可以获得完全敲除的单细胞克隆株。