WAKO-隐形RNA载体技术的研发及其在ips细胞重编中的应用

新技术：什么是隐形RNA载体（SRV）？

• SRV基因组是由结构优化的人工RNA构建的，因此人类细胞很难将SRV识别为外来物质（病原体）（=隐形）。因此，干扰素和炎性细胞因子的诱导受到抑制，且细胞毒性极低。

• 由搭载所必需的最少元素基因组成，并且由于缺乏制造病毒样颗粒的所有基因，因此非常安全。

• 不会将核酸插入宿主细胞的基因组DNA中，也没有遗传毒性，且能够使用自身的RNA聚合酶在细胞质中长期持续地表达基因。此外，可以在不再被需要时随时从细胞中清除。

• 可以同时搭载10个或更多基因（总共可达14 kb），因此可以支持使用大量基因的高级重编程技术，例如不涉及 iPS 细胞的直接重编程。

• 可根据目的选择不同基因表达水平的载体

  
  

• 弱度表达载体→基因治疗・细胞重编程 • 中度表达载体→细胞重编程 • 强度表达载体→抗体生产

在隐形RNA载体内，由人工核酸组成的 RNA 转录系统被包裹在直径为 240 nm 的病毒样颗粒中。

该载体可在 -80°C 下半永久冷冻保存，并在 4°C 下稳定保存 2 天。

隐形RNA载体搭载基因的表达

• 可见10个基因均有很好的被表达

隐形RNA载体的开发

仙台病毒cl.151的发现

仙台病毒cl.151持续感染猴肾细胞

仙台病毒的细胞毒性（感染12小时）

cl.151株较野生仙台病毒的细胞毒性更低，且可以持续感染细胞，有望作为新的病毒载体。

仙台病毒的基因结构

2005年首次成功克隆仙台病毒cl.151的基因组，并分析得到其具体结构功能。

仙台病毒基因组核衣壳

仙台病毒基因组RNA

仙台病毒基因组RNA

仙台病毒cl.151的基因组RNA具有与哺乳动物mRNA相似的结构，并由RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）介导进行翻译表达。

仙台病毒cl.151的持续表达性

搭载有EGFP的仙台病毒CL.151载体可不插入基因并长时间表达EGFP。

仙台病毒cl.151的细胞毒性

M，F，HN基因敲除实验

缺陷持续表达型仙台病毒载体SeVdp的开发

基于SeVdp载体的重编程原理

SeVdp与普通仙台病毒载体的比较

目前常用iPS重编程用载体无法搭载大量基因，必须将重编程基因分别搭载于不同载体，但SeVdp实现了4个重编程基因搭载于一个载体，实现更高效的重编程。

多个基因搭载于同一载体的重要性

使用SeVdp-iPS技术进行人PBMC重编程

SeVdp载体的去除

• 约10天到达检测限以下，将这些细胞继续培养30天，并未检测到含有载体基因的细胞。

• 由此，10天的siRNA处理可从细胞内完全去除该载体。