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海星生物:sgRNA的设计与质粒构建方法

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发表时间:2024-05-28 13:14作者:诺扬生物来源:海星生物

sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用,其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等,甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此,设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。sgRNA包括20nt的靶向序列,crRNA,linker loop 和 tracrRNA几个部分共同组成(图1)。通常我们所说的sgRNA设计指的就是针对20nt的靶向序列进行设计,而选择合适的靶向序列就是sgRNA设计的核心工作。

sgRNA的设计流程

       


sgRNA的设计原则

1. 特异性:确保sgRNA是特异性的,以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域,特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。

2. sgRNA的长度:S. pyogenes II型CRISPR系统(SpCas 9)一般为20nt。

3. GC含量均衡:sgRNA的GC含量应该在40-60%之间,以确保在实验条件下有适当的稳定性和杂交性。
4. 避免多个剪切位点:选择只有一个目标剪切位点的sgRNA,以避免非预期的多基因编辑。
5. 避免重复序列:避免选择在基因组中存在重复序列或高度相似序列的区域,以减少非特异性剪切的可能性。
6. 避免RNA结构影响:确保sgRNA序列不包含稳定的二级结构,以提高在实验条件下的有效性。
7. 全基因的脱靶效应分析,需要考虑脱靶位点的错配碱基数,最多不超过5个。可通过sgRNA设计软件筛选出移码突变率高且脱靶位点较少的sgRNA。

8. 构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。

9. 若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于第一或第二外显子上,以生成无功能性蛋白。

10. 当基因存在多个转录本时,最好将sgRNA设计在同源区域。

sgRNA的设计

此处以查询人类WNT10B基因为例。在NCBI Gene数据库中输入需要查找的人类WNT10B基因,查找的结果显示多个与WNT10B相关的基因,这些基因包括了不同物种的WNT10B同源基因。因而查找时需要注意该基因在NCBI的登录号与种属描述等。点击查询人类WNT10B基因,显示出该基因的基本信息(图1)。


(图1) NCBI网站查询WNT10B基因信息


找到该基因的mRNA and Protein(s) 相关信息,查询可知WNT10B的mRNA 编号为 NM 003394.4。如果该基因可以通过可变剪接产生多个mRNA亚型的话,在下图中会依次记录(图2)。

(图2)NCBI网站查询WNT10B基因mRNA信息


使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析,如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子,其中粉色区域为信号肽所在序列,该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除,sgRNA设计时应避免此段序列,最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译,也应该避免采用此段序列,所以最佳的sgRNA靶向序列应采用图中蓝色选定区域(图3)。

   

(图3)WNT10B基因结构组成图示


选取上图中序列作为sgRNA的靶序列,在sgRNA设计网站输入靶基因信息和设计相关信息。

现在有多种sgRNA设计网站可供选用,常用的设计网站包括:

1. CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)

2. GPP Web Portal (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public/)

3. E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)

4. CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/)

此处我们选择张锋实验的CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)来进行sgRNA的设计,输入上文选择的靶序列,选定基因对应的物种信息和想要使用的Cas9和PAM种类后点击提交(图4)。

(图4sgRNA设计网站界面


网站生成的sgRNA序列和相关信息如下图所示,信息包括sgRNA的位置,网站给出的特异性评分,切割效率评分,潜在的脱靶结果和脱靶位点相关信息(图5)。

   

(图5)网站生成的sgRNA方案和分析


sgRNA质粒的构建方法

1. 酶切载体

LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。


2. 寡核苷酸链引物退火
体系:

试剂

使用量

oligo 1 (100μM)

1ug

oligo 2 (100μM)

IμL

T4 Ligation Buffer(NEB)

1μL

ddH2O

6.5μL

T4 PNK (NEB)

0.5μL

总体系

10μL


退火参数:

37℃ 30 分钟,95℃ 5 分钟,然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃


3. 连接

体系:一般室温放置20-30分钟(NEB的快速T4连接试剂盒)

样品

使用量

酶切好的LentiCRISPR-V2载体(50ng)

XμL

第3步中磷酸化与退火后的引物(1:100稀释)

1ul

2XQuickligation Buffer (NEB)

5ul

Quick Ligase (NEB)

1μL

ddH20

XμL

subtotal

10 μL

Quick Ligase (NEB)

1 μL

Total

11 μL


4. 质粒转化:
① 从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟;
② 冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟;
③ 加入500 μL预热至室温的LB培养基,将混合物置于37℃摇床中摇菌30分钟;

④ 以3000 r/min离心3分钟,弃掉上清,利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿(AMP抗性),随后在37℃培养箱中过夜生长。

5. 挑取单克隆,摇菌,菌落PCR。

6. 对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳,运用凝胶成像仪进行成像,并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定。

7. 基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养,提取质粒以备用于后续实验室实验。


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