【Bioss讲堂】Western blot内参抗体选择攻略大全

内参的重要性

Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少——即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。内参的意义就是保证上样量的一致。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。内参抗体在目标蛋白的免疫荧光研究中，也可以作为共染的阳性对照。内参抗体分为未标记型和标记型，标记物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料等。

●      选择内参抗体应遵循的原则     ●

样本来源

♠哺乳动物的组织或细胞：β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等；

♠植物样本：plant actin、Rubisco 等；

♠其他来源样本，应参照已发表文献,选择合适蛋白作为内参。

目的蛋白定位

▶全细胞蛋白和细胞质：β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；

▶细胞核蛋白：PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3，K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等；

▶胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等；

▶线粒体蛋白：VDAC1、COXIV等；

▶血清：Transferrin等。

目的蛋白分子量

目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上，各内参蛋白分子量详见下方汇总表。

Tips

内参的选择还需要考虑实际的试验环境：

★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；

★而在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参；

★涉及细胞增殖的相关试验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参；

★凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参；

★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin和β-Tubulin。

★做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参。

※ 设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。