—关于UniTantrix™ 可溶解型微载体
哺乳动物细胞体外培养在生物制商行业中扮演着非常重要的角色，其主要涉及领域包括度疫苗（病毒）、酶、生物激素、抗体及医用蛋白等。在工业级大规模生产过程中微载体（microcarriers）的使用起到尤为关键的作用，其可以大量降低成本，实现更具性价比大规模生产。通常微载体主要可以为贴附型细胞（anchorage-dependent cells）温供一个合适的贴附及生长环境。然而现阶段主要遇到的问题，通过微载体进行细胞培养上游生产时，细胞很难有效的从微载体上分离下来，导致最终产物（病毒、抗体及细胞等）进入下游生产环节时需通过过滤或离心等方式才能与微载体分离，但这些分离过程会导致量终产物损失并增加下游环节的生产难度，从而进一步导致生产成本的上张。Uniantrix™ 作为可溶解型微载体，可以解决上述问题，并为您提供一个理想的培养方案。通过UniTantrix™微载体可溶解的特性可以进行细胞的完整回收，有效地将细胞与微载体分离，为生物制药产业上下游生产环节带来更为简单、经济的大规模量产方式。
UniTantrix™可溶解型微载体尺寸大小为500-850um，除了可以有效溶解并与细胞分离的特性之外，其内部规则排列的微米多孔结构也为细胞生长提供了有效的表面积和微环境，并提供了更多的内部生长空间来保护细胞，使其承受较小的剪切力伤害。此外，胶原面自（denatured collagen）的材质还促进了哺乳动物细胞的贴附及增殖。基于上述种种优点。UniTantrix™可溶解型微载体为大规模生产生物制剂（或免段疗法所需细胞或干细胞扩增等）提供更具性价比的产品选择。
—UnTantrix™ 微载体的优势∶
·胶原蛋自材质（denatured collagen，BSE/TSE free certificate）∶促进哺乳动物细胞的贴附和增殖
·多孔结构且孔孔道通∶有效表面积大于~6000cm²/g
·多孔结构保护细胞免受剪切力伤害：可实现高细胞产量及高细胞活性
·可溶解性：高细胞回收率
·批次差小
—培养过的细胞类型
—UniTantrix™微载体应用案例
操作说明
※此操作说明仅适用于使用UniTantrix™微载体进行细胞培养的使用者（以100毫升之体积为例）。
所需材料及设备
• UniTantrix™微载体
• 硅化处理过的BELL-FLO™旋转搅拌瓶（spinner flask/125mL）或Corning® ProCulture®旋转搅拌瓶（spinner flask/125m）
（注意事项∶使用玻璃旋转搅拌瓶前，应于容器之内表面做硅化处理，以防止微载体粘附于玻璃容器）
慢速磁力搅拌器
• 细胞培养液（无血清来源也可使用）
• 缓冲液（PBS，无钙镁磷酸盐酸盐）
• 胰蛋白酶（Trypsin-EDTA or TrypLE）
• LIVE/DEAD™细胞毒性试剂盒（哺乳动物细胞适用）
• 37℃，5%CO₂，恒温培养箱
UniTantrix™微载体浸润（Hydration）
1.秤取0.2克的UnTantrx™微载体于硅化处理之玻璃旋转搅拌瓶中。
2.加入100ml的缓冲液，最终浓度为2克/升。
3.高温高压灭菌使其浸涧（121℃，20分钟）。
4.冷却至室温使用。
细胞培养液体平衡（Equillbration）
1.静置且自然沉降UniTantrix™微载体
2.将缓冲液进行半换液，加入50ml的细胞培养液（总体积的一半）。
(注意事项∶小心换液操作，不可吸取到UniTantrix™微载体，且需沿着搅拌瓶壁加入培养液，以免打入过多空至UniTantrix™微载体内部
3.将UniTantrix™/旋转搅摔瓶放入细胞培养箱，以转速40 rpm平衡至少10分钟以上
细胞接种（Seeding）
A.人类间充质干细胞
1.于含有02克UniTantrx™微载体(6000平方公分/克）的旋转搅拌瓶中，接种3*10颗胞数（初始接种
胞浓度为2500颗细胞数/平方公分）。
2.放入细胞培养箱先以25rpm转速搅拌2分钟后，再静置30分钟。（注意事项∶此为一个循环。）
3.重复上述之间歇性搅拌8个循环（cycles）。
4.8个循环结束后，将细胞培养液增补至100ml再以25rpm持续搅拌。
B.Vero cell培养
1.于含有0.2克UniTantrx™微载体（6000平方公分/克）的旋转搅拌瓶中，接种2.2*10颗细胞数
（初始接种细胞浓度为18000颗细胞数/平方公分）。
2.植入细胞后，将细胞培养页增补至100ml再以4rpm转速持续搅拌。
细胞扩增（Expansion）
A 人类间充质干细胞（hMSC）:于干细胞扩增时，应随着培养天数的增而增加搅拌速度，以避免微载体间的团聚现象。
1.细胞接种一天后，增至30rpm转速搅拌，第三天提升至转速35rpm，第五天提升至转速45rpm,第七天提升至转速50rpm。
B Vero cell培养：以40~50rpm转速持续搅拌，进行细胞扩增
注意事项
a 更换培养液时，更换总体积之70%的量即可，以总体积100毫升为例，更换培养液的体积为70毫升。而更换培养液的天数及体积更具不同细胞种类做调整。
b 搅拌速度可根据不同种类细胞或培养天数做实时调整。
c 对于超过七天的长期培养，应随时调整搅拌转速一维持微载体于旋转搅拌瓶中完全悬浮性。
细胞分析/观察Visualizatlon）
1于持续均匀震荡homogeneously的旋转搅拌瓶中，缓慢吸取1毫升之细胞/微载体的悬浮液，放置于平面多孔盘上（well plate）
2以倒置显检镜观察微载体中的细胞或将细胞/微载体进行荧光染色观察。
细胞计数（Counting）
1 于持续均匀震荡的旋转搅拌瓶中，缓慢吸取细胞/照判/微载体的悬浮液1毫升并放入微量离心管中。
2 静置细胞/微载体完全沉降到离心管底部后，缓慢移除细胞培养液。
（注算事项：移除细胞培养液时，不可吸取到细胞/微载体）
3移除细胞培养液后以缓冲清洗三次
4.加入0.5-1毫升胰蛋白酶液Trypsin-EDTA or TrypLE溶解细胞/微载体
5放入细胞培养箱反应10-15分钟
6.加入含血清的培养基或胰蛋白酶抑制剂来中止反应后，进行细胞计数
细胞回收（Harvesting）
1.将培养用旋转搅拌瓶静置10分钟，直到所有细胞/微载体皆沉降搅拌瓶到底部后，缓慢移除细胞培养液。（注意事项：移除细胞培养液时，不可吸取到细胞/微载体）
2.移除细胞培养液后以缓冲液清洗三次。
3.加入30-50毫升胰蛋白酶（Trypsin-EDTA or TrypLE）溶解所有细胞/微载体。
4.混合均匀后病防治于37℃，并以转速50RPM反应15-20分钟。
5.微载体溶解后，回收所有细胞悬浮液至50毫升的离心管。
（注意：当微载体完全溶解后，加入含血清的培养基或胰蛋白酶抑制剂中止酶反应以避免细胞伤害。）
6.以转速1200rpm离心10分钟。
7.移除上清液后，在用新的培养液重悬细胞。
产品参数
| UniTantrix™ 微载体 |
材料 | 胶原蛋白（Denatured collagen) |
密度 | 1～1.1克/毫升 |
直径 | 500-850微米 |
孔洞大小 | ～150微米 |
表面积 | ～6000平方公分/克 |
可溶解性 | Trypsin-EDTA（or Tryple) |
产品列表：
货号 | 品名 | 规格 | 价格 |
GGB120000 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 500mg/vial，sterile | 150 um(孔径） | 126 |
GGB120001 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 1g/vial，sterile | 150 um(孔径） | 197 |
GGB120005 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 5g/vial，sterile | 150 um(孔径） | 857 |
GGB120010 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 10g/vial，sterile | 150 um(孔径） | 1588 |
GGB120001-03 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 1g/vial，3×vials , sterile | 150 um(孔径） | 560 |
GGB120010-05 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 10g/vial，5×vials ,sterile | 150 um(孔径） | 7686 |
GGB120020 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 20g/vial，sterile | 150 um(孔径） | 3150 |
GGB120011 | Dissolvable microcarriers collagen，weight 100g/vial，sterile | 150 um(孔径） | 15120 |
Tantti UniTantrix 可溶性多孔微载体客户询问Q&A：
Q.当在三维培养中，可以直接在其中加药吗？
A.可以直接在三维培养中加药的，但一般药物是提前加在培养基中的。
Q.在细胞治疗中比较在意新物质引入，在溶解微载体时，会使用胰酶以及降解后的胶原蛋白，这个怎么处理呢？
A.UniTantrix微载体除了使用胰酶，也可以使用TrypLE，TrypLE相对胰酶是比较温和的，TrypLE是植物来源相对会更安全。一般如果回收干细胞，消化之后完全溶解可用离心方式弃上清，再加上一些新的buffer等，做细胞回收应用，相对外来物质降低很多。
Q. 干细胞要不要微载体，收集量有区别吗？
A. 间充质干细胞或者脂肪来源的或脐带来源的都属于贴附性细胞类型所以是需要的；收集量的使用微载体收集量会比较高，效率会比较好。
Q.细胞长在微载体上，后续方便消化下来吗，还是需要使用特定的消化液？
A.一般消化使用EDTA，但建议使用TrypLE，非动物来源的比较适合。
Q.请问培养时如何看悬浮细胞培养的活性？
A.取1cc含有微载体的层析液，把微载体溶解，看溶液之后细胞活性，可用荧光染色的方式观察细胞活性。
Q.GE的微载体可以重复使用，大概可以利用三四次，相对容易降低成本？
A.像欧美严格的法规来说时不太允许重复使用，讲究一次性方式；当然重复使用微球表面经过消化之后比较粗糙，细胞喜欢贴附在旧的上面，新加入的就贴附比较少，就有可能会产生几天之后新的长不上去的情况。
Q.一般先将细胞铺板，再进行造膜加药培养，后续再测指标，请问细胞是在旋转器里培养吗？那检测细胞活力或者其他指标，可以直接将细胞种到96孔板或者其他孔板中进行培养加药吗？还是要先将微载体消化？
A.如果是要对比二维和三维培养看药物对不同维度对细胞的影响的话，建议直接将微载体放到孔板里面进行培养。
Q.再换培养液的时候，需要消化掉微载体吗，还是说只要加入新的微载体就可以，有反馈目前的微载体，换液时只需要加入新的微载体，两个微载体之间经过碰撞就会让细胞增殖到新的微载体上，请问我们的产品，能否也可以这样操作（能否进行球转球？）
A.UniTantrix微载体不建议球转球，建议先做消化再转移到新的上面比较适合，所谓微载体到微载体的转换（球转球）有两种方法，一是完全消化下来转到新的载体上面，欧美法规都倾向于这种方法；二是将新旧按一定比例混合，但是细胞喜欢旧的，只有旧的长满后才转到新的上面。但是用UniTantrix微载体经济效益更高，成本只是GE的40%。
Q.有没有养过心肌细胞的三维培养？
A.有养过平滑肌细胞，也发表过文献。
Q.UniTantrix微载体是否有更小的孔径，5um左右的，可以作为类似于磁珠，用于偶联抗体？
A.目前还没有现成的产品，但是在规划中，可以做到多孔径3-5um。
Q.UniTantrix微载体能不能做到两种细胞co-culture？
A.静态的co-culture是时可以的，两种细胞的co-culture是没问题的。
Q.UniTantrix微载体培养多久需要换新的？
A.UniTantrix微载体是生物可降解材料，在搅拌情况下可以使用14天，因为是天然高分子材料会有水解或降解的可能。
Q.之前看到台创新有3D培养支架可注射型，以及非动物来源材料支架，请问有类似的产品吗？
A.UniTantrix微载体是胶原蛋白，在2D培养上非动物来源材料的支架有不错的结果，非动物来源材料的微载体现在还在测试。
Q.UniTantrix微载体同比市场同款产品，性能差别大吗？
A.不同领域做过竞品分析，疫苗制程和GE（思拓凡）做过对比，从数据看出UniTantrix微载体使用的量少也能产生大量的细胞；细胞制药领域和康宁对比24小时细胞贴附率更好。同时UniTantrix微载体是多孔结构细胞长在内部更好的保护细胞，像GE和康宁是微球长在表面处理过程会有损耗。
Q.请问搅拌瓶是否有提供，可不可以循环利用？
A.没有制作瓶子，现在使用的是康宁橘色的玻璃瓶的比较适合，康宁的清洗干净可以重复使用，也有一次性的包装可以选择。
Q.是否有相关文献可以下载？
A.可以直接在www.tantti.com查询。
Q.UniTantrix微载体有FDA认证吗，有时比较在意产品是否能合规应用于细胞治疗方向的细胞培养？
A.UniTantrix微载体是辅助材料，不是植入性物质，所以没有FDA认证，但有做生物安全性检测，有相关检测报告可以提供。
Q.请问UniTantrix微载体可以作为纤维细胞培养吗
A.可以的。
Q.胰酶消化后，有对胶原酶解产物残留分析吗？
A.残留的消化酶可以做分析，如果残留消化酶对细胞有影响的话可以做几种方法，离心弃上清，再用培养基清洗，多处理几次会最大程度降低残留。
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